HEK293T細胞におけるアポトソームバイオセンサーに影響を与える実験変数の最適化

Optimization of Experimental Variables Influencing Apoptosome Biosensor in HEK293T Cells.

• Azarakhsh Oladzad
• Maryam Nikkhah
• Saman Hosseinkhani

抄録

アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1（Apaf-1）スプリットルシフェラーゼバイオセンサーは、アポトーシスの早期検出のための生物学的ツールとして使用されてきた。細胞ベースのアッセイでのドキソルビシンの効果と、無細胞系でのチトクロームとATPの添加により、アポトソーム形成の検出のためのレポーターの機能性を試験してきた。本研究では、アポトソーム形成を誘導するためのバイオセンサー自体の発現に依存するアポトーシス誘導の方法を、薬剤やチトクローム/ATPに依存しない方法で確立した。Apaf-1を過剰発現させることで、薬剤処理を行わない場合でも、スプリットルシフェラーゼ活性とカスパーゼ-3活性が上昇した。カスパーゼ-9DNを共発現させた場合、カスパーゼ-3活性は有意に抑制され、Apaf1バイオセンサーの活性は有意に上昇した。これらの結果から、Apaf-1バイオセンサーはエトポシド誘発アポトーシスを検出しないことが明らかになった。

The apoptotic protease-activating factor 1 (Apaf-1) split luciferase biosensor has been used as a biological tool for the detection of early stage of apoptosis. The effect of doxorubicin in a cell-based assay and the addition of cytochrome and ATP in a cell-free system have been used to test the functionality of the reporter for the detection of apoptosome formation. Here, our data established a drug- and cytochrome /ATP-independent way of apoptosis induction relying on the expression of the biosensor itself to induce formation of apoptosome. Overexpression of Apaf-1 constructs led to increased split luciferase activity and caspase-3 activity in the absence of any drug treatment. Caspase-3 activity was significantly inhibited when caspase-9DN was co-overexpressed, while the activity of the Apaf1 biosensor was significantly increased. Our results show that the Apaf-1 biosensor does not detect etoposide-induced apoptosis.