デオキシイノシン含有オリゴヌクレオチドとエンドヌクレアーゼVを用いたランダム領域を含むフラグメントからの大規模DNAライブラリーの体外構築

In Vitro Construction of Large-scale DNA Libraries from Fragments Containing Random Regions using Deoxyinosine-containing Oligonucleotides and Endonuclease V.

• Yasuhide Yamamoto
• Takuya Terai
• Shigefumi Kumachi
• Naoto Nemoto

抄録

DNAライブラリーを効率的かつ正確に構築することは、ポリペプチドの有向進化のための基本的な出発点です。最近、タンパク質発現のために細胞に依存しないいくつかのインビトロ選択方法が報告されており、ここでは、10種のオーダーのペプチドライブラリーがインビトロのアフィニティ選択に使用されている。それらの可能性を最大化するためには、細菌の形質転換を伴わないランダム領域を含むいくつかのフラグメントからのＤＮＡライブラリーの単純でありながら汎用性の高い構築が不可欠である。この問題に対処するために、我々はここで、その5'末端付近に単一のデオキシイノシン（I）残基を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマーの使用に基づく新しいDNA構築方法を提案する。PCR産物をエンドヌクレアーゼVで処理すると、カスタマイズされた長さと配列を持つ3'オーバーハングが生成され、これは正確に相補的なオーバーハングを持つ他のフラグメントと正確かつ効率的に結紮することができる。概念の証明として、我々は4つのDNA断片からシングルドメイン抗体の人工遺伝子ライブラリーを構築した。

Efficient and precise construction of DNA libraries is a fundamental starting point for directed evolution of polypeptides. Recently, several in vitro selection methods have been reported that do not rely on cells for protein expression, where peptide libraries in the order of 10 species are used for in vitro affinity selection. To maximize their potential, simple yet versatile construction of DNA libraries from several fragments containing random regions without bacterial transformation is essential. To address this issue, we herein propose a novel DNA construction methodology based on the use of polymerase chain reaction (PCR) primers containing a single deoxyinosine (I) residue near their 5' end. Treatment of the PCR products with endonuclease V generates 3' overhangs with customized lengths and sequences, which can be ligated accurately and efficiently with other fragments having exactly complementary overhangs. As a proof of concept, we constructed an artificial gene library of single-domain antibodies from four DNA fragments.