ゴムの木の内生菌株ITBB B5-1の野生株と変異株の遺伝子解析と免疫電子顕微鏡は、プロジゴシンの貯蔵と分泌におけるマクロベシクルの重要な役割を明らかにした

Genetic Analysis and Immunoelectron Microscopy of Wild and Mutant Strains of the Rubber Tree Endophytic Bacterium Strain ITBB B5-1 Reveal Key Roles of a Macrovesicle in Storage and Secretion of Prodigiosin.

• Deguan Tan
• Lili Fu
• Xuepiao Sun
• Long Xu
• Jiaming Zhang

抄録

ゴムの木は経済的に重要な熱帯作物である。その内生菌であるITBB B5-1は、細胞内にマクロベシクルと赤色色素を保有している。本研究では、四重極飛行時間型質量分析法により、この赤色色素をプロジゴシンと同定した。プロジゴシンは、抗がん剤や抗臓器移植拒絶反応など、幅広い医学的価値が期待されています。ITBB B5-1株はプロジゴシンを2000 mg/Lまで蓄積しており、これはほとんどの既知の株と比較して高い生産量である。また、マクロベシクルの形成とプロジゴシンの生合成には高い関連性があり、時間および温度に依存していた。その結果、プロジギオーシンを産生しない変異株B5-1muが得られた。野生株と変異株の全ゲノムシークエンシングの結果、B5-1mu株ではプロジゴシン合成経路の最終段階の酵素をコードする遺伝子が17-bp欠失により変異していることが明らかになった。透過型電子顕微鏡で解析したところ、変異株ではマクロベシクルが存在しないことが明らかになり、マクロベシクルの形成はプロジギオーシン生合成に依存していることが示唆された。また、プロジギオーシン特異的抗血清を用いた免疫電子顕微鏡分析では、マクロベシクル、細胞壁、細胞外小胞にプロジギオーシンが存在することが示されたが、変異株では免疫反応は観察されなかった。これらの結果は、マクロベシクルがプロジゴシンの貯蔵オルガネラとして機能し、プロジゴシンを細胞外小胞として細胞エンベロープや培地に分泌していることを示している。

Rubber tree is an economically important tropical crop. Its endophytic bacterial strain ITBB B5-1 contains an intracellular macrovesicle and red pigment. In this research, the red pigment was identified as prodigiosin by quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Prodigiosin has a wide range of potential medical values such as anticancer and antiorgan transplant rejection. The strain ITBB B5-1 accumulated prodigiosin up to 2000 mg/L, which is higher production compared to most known strains. The formation of the macrovesicle and prodigiosin biosynthesis were highly associated and were both temporal- and temperature-dependent. A mutant strain B5-1mu that failed to produce prodigiosin was obtained by ultraviolet mutagenesis. Whole genome sequencing of wild-type and mutant strains indicated that the gene encoding the last-step enzyme in the prodigiosin biosynthesis pathway was mutated in B5-1mu by a 17-bp deletion. Transmission electron microscopy analysis showed that the macrovesicle was absent in the mutant strain, indicating that formation of the macrovesicle relied on prodigiosin biosynthesis. Immunoelectron microscopy using prodigiosin-specific antiserum showed the presence of prodigiosin in the macrovesicle, the cell wall, and the extracellular vesicles, while immuno-reaction was not observed in the mutant cell. These results indicate that the macrovesicle serves as a storage organelle of prodigiosin, and secretes prodigiosin into cell envelop and culture medium as extracellular vesicles.