桂皮の5-ホスホメバロネートキナーゼ遺伝子(CcPMK)のクローニングと発現解析

[Cloning and expression analysis of 5-phosphomevalonate kinase gene (CcPMK) in Cinnamomum camphora].

• Han Zheng
• Mu-Yao Yu
• Chun-Juan Pu
• Mei-Lan Chen
• Fu-Quan Li
• Ye Shen
• Lu-Qi Huang

抄録

5-phosphomevalonate kinase(PMK)は、ATPとMg~(2+)などの二価金属イオンの存在下で、メバロニン酸5-リン酸(MVAP)のリン酸化を可逆的に触媒し、メバロニン酸5-二リン酸(MVAPP)を形成するメバロニン酸(MVA)経路の鍵を握る酵素であり、本研究では、C. camphora由来のcDNAをクローニングし、CcPMKと命名しました。本研究では、Cinnamomum camphoraのトランスシプトームデータベースに基づき、C. camphoraからcDNAによりPMKをクローニングし、CcPMKと命名した（GenBank number KU886266）。CcPMKのORFは1,545bp、514アミノ酸をコードしていた。CcPMKのバイオインフォマティクス解析の結果、コードされたタンパク質の分子量は56.14 kDa、理論上の等電点は7.64であり、シグナルペプチドや膜貫通構造は存在しないことが明らかになった。多重配列アラインメントと系統樹解析により、他の植物のCcPMKとPMKのアミノ酸配列の類似度は75%と高いことがわかった。類似する配列のうち、45%がアルファヘリックスに属し、16%がベータ鎖に属していた。CcPMK は PMK タンパク質ファミリーの 3 つのモチーフと 1 つの ATP 結合部位 Gly-Leu-Gly-Ser-Ser-Ala-Ala を得ており、その 3 つの D 構造には触媒ポケット構造が含まれており、CcPMK が PMK 遺伝子ファミリーの一員であることが証明された。系統樹の結果、CcPMK は Phonenix dactylifera などの単子葉植物と近縁であることが示された。リアルタイムPCRの結果、リナロール型、シネオール型、イソネロリドール型、カンファー型よりもボルネオール型の方がCcPMKの発現レベルが高いことが示された。CcPMKは根で最も発現が高く，枝で最も発現が低かった。以上の結果から、CcPMKの発現レベルは5種類の化学種や植物組織間で異なることが明らかになり、C. camphoraのテルペノイド生合成経路の研究をさらに進めるための基礎となる研究である。

The 5-phosphomevalonate kinase(PMK) is a key enzyme in mevalonate(MVA) pathway which reversibly catalyzes the phosphorylation of mevalonate 5-phosphate(MVAP) to form mevalonate-5-diphosphate(MVAPP) in the presence of ATP and divalent metal ion such as Mg~(2+). In this research, on the basis of the transciptome database of Cinnamomum camphora, the PMK was cloned by cDNA from C. camphora, and was named CcPMK(GenBank number KU886266). The ORF of CcPMK was composed of 1 545 bp, encoding 514 amino acids. The bioinformatics analysis of CcPMK indicated that the molecular weight of the encoded protein was 56.14 kDa, with a theoretically isoelectric point of 7.64, and there was no signal peptide and transmembrane structure in putative protein. By multiple sequence alignment and phylogenetic tree analysis, we found that similarity between CcPMK and PMK amino acid sequence of other plants was as high as 75%. Among the similar sequences, 45% of them belonged to the alpha helix, while 16% belonged to the beta strand. CcPMK obtained 3 PMK protein family motifs and 1 ATP binding site Gly-Leu-Gly-Ser-Ser-Ala-Ala, and its 3 D structure contained a catalytic pocket structure, proving CcPMK as a member of PMK gene family. The result of phylogenetic tree showed that CcPMK was closely related to monocotyledon plants such as Phonenix dactylifera. The results of the Real-time PCR indicated that the expression level of CcPMK in borneol type was higher than that in linalool type, cineol type, iso-nerolidol type and camphor type. CcPMK expressed highest in roots and lowest in branches. Our results revealed that the expression level of CcPMK was different among five chemical types and different plant tissues, and the research provides foundation for further study of the terpenoids biosynthetic pathway in C. camphora.