バクテリオファージT4 Rad50のC末端領域の機能評価

Functional evaluation of the C-terminal region of bacteriophage T4 Rad50.

• Haley E Streff
• Yang Gao
• Scott W Nelson

抄録

バクテリオファージT4は、Rad50（gp46）とMre11（gp47）のオルソログをコードしており、これらのタンパク質はヘテロ四量体複合体（MR）を形成し、組換え依存性DNA修復のためのDNA末端処理に関与している。Rad50の結晶構造と高分解能低温電子顕微鏡構造から、Mre11とは反対側のRad50の二量体界面付近と、球状頭部ドメインからはみ出したコイル状コイルの基部付近にDNA結合部位があることが明らかになった。DNA結合残基を同定するためのシークエンスベースのアルゴリズムを用いたT4-Rad50の解析から、観測された結合部位の遠位にあるC末端付近の正に帯電した残基の保存領域がDNAと相互作用していることが予想された。この予測を検証するために変異体タンパク質を作製し、その酵素活性とDNA結合活性を評価した。予測と一致するように、Rad50C末端変異体は、Rad50平衡DNA結合アッセイで測定されるようにDNAに対する親和性が低下し、MR複合体ヌクレアーゼアッセイで測定されるようにKm-DNAが増加していた。さらに、DNA結合によるATP加水分解活性のアロステリック活性化が大幅に減少したことから、これらの残基がDNAとATP結合部位の間のコミュニケーションに関与している可能性が示唆された。

Bacteriophage T4 encodes orthologs of the proteins Rad50 (gp46) and Mre11 (gp47), which form a heterotetrameric complex (MR) that participates in the processing of DNA ends for recombination-dependent DNA repair. Crystal and high-resolution cryo-EM structures of Rad50 have revealed DNA binding sites near the dimer interface of Rad50 opposite of Mre11, and near the base of the coiled-coils that extend out from the globular head domain. An analysis of T4-Rad50 using sequenced-based algorithms to identify DNA binding residues predicts that a conserved region of positively charged residues near the C-terminus, distal to the observed binding sites, interacts with DNA. Mutant proteins were generated to test this prediction and their enzymatic and DNA binding activities were evaluated. Consistent with the predictions, the Rad50 C-terminal mutants had reduced affinity for DNA as measured by Rad50 equilibrium DNA binding assays and an increased Km-DNA as determined in MR complex nuclease assays. Moreover, the allosteric activation of ATP hydrolysis activity due to DNA binding was substantially reduced, suggesting that these residues may be involved in the communication between the DNA and ATP binding sites.

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