ヒトリボヌクレアーゼダイサーの未知の活性領域。デオキシリボヌクレアーゼ活性を有すると考えられる

Unknown Areas of Activity of Human Ribonuclease Dicer: A Putative Deoxyribonuclease Activity.

• Marta Wojnicka
• Agnieszka Szczepanska
• Anna Kurzynska-Kokorniak

抄録

ダイサーリボヌクレアーゼは、長鎖二本鎖RNAと一本鎖ヘアピンRNAの前駆体をそれぞれ小型干渉RNA(siRNA)とマイクロRNA(miRNA)に処理することで、小型調節RNA(srRNA)の生合成に重要な役割を果たしている。ダイサーで生成されたsrRNAは、相補的な転写産物を標的とし、その翻訳を抑制したり、その切断を誘導したりすることで、遺伝子の発現を制御することができます。ヒトダイサー（hDicer）は、ヘリカーゼドメイン、DUF283ドメイン、プラットフォーム、PAZドメイン、コネクターヘリックス、2つのRNase IIIドメイン（RNase IIIaおよびRNase IIIb）、およびdsRNA結合ドメインからなるマルチドメイン酵素である。RNA基質がプラットフォーム-PAZ-コネクターヘリックス(PPC)領域内に固定されている場合、ダイサーによって2塩基(nt)3'オーバーハングを持つ20塩基対の特異的なsiRNAまたはmiRNAデュプレックスが生成される。しかし、多くの報告では、PAZドメインが存在しない場合、RNA基質の結合は他のダイサードメインによって起こりうることが示されている。興味深いことに、PPC領域を欠いたダイサーの切り捨て変異体はDNase活性を示すことがわかっている。これらの知見に触発されて、我々は、PAZドメインの欠如、またはPPC領域全体の欠如がhDicerの開裂活性にどのように影響するかを調査した。ヒト細胞で作製した免疫精製3xFlag-hDicerとその2つの変異体（PAZドメインを欠失したものとPPC領域全体を欠失したもの）を用いて、PAZドメイン欠失変異体のhDicerは、pre-miRNA基質、2-nt 3'-オーバーハングを持つ2本鎖RNA、およびblunt-end 2本鎖RNAを処理できないことを示した。しかし、PAZ 欠失変異体は、それぞれ短い一本鎖 RNA と DNA に対して、RNase と DNase の両方の活性を示した。これらの結果は、PAZドメインが欠失している場合、他のhDicerドメインが基質結合に寄与する可能性があり、この場合、非カノニカルな生成物が生成され得ることを示唆している。

The Dicer ribonuclease plays a crucial role in the biogenesis of small regulatory RNAs (srRNAs) by processing long double-stranded RNAs and single-stranded hairpin RNA precursors into small interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs), respectively. Dicer-generated srRNAs can control gene expression by targeting complementary transcripts and repressing their translation or inducing their cleavage. Human Dicer (hDicer) is a multidomain enzyme comprising a putative helicase domain, a DUF283 domain, platform, a PAZ domain, a connector helix, two RNase III domains (RNase IIIa and RNase IIIb) and a dsRNA-binding domain. Specific, ~20-base pair siRNA or miRNA duplexes with 2 nucleotide (nt) 3'-overhangs are generated by Dicer when an RNA substrate is anchored within the platform-PAZ-connector helix (PPC) region. However, increasing number of reports indicate that in the absence of the PAZ domain, binding of RNA substrates can occur by other Dicer domains. Interestingly, truncated variants of Dicer, lacking the PPC region, have been found to display a DNase activity. Inspired by these findings, we investigated how the lack of the PAZ domain, or the entire PPC region, would influence the cleavage activity of hDicer. Using immunopurified 3xFlag-hDicer produced in human cells and its two variants: one lacking the PAZ domain, and the other lacking the entire PPC region, we show that the PAZ domain deletion variants of hDicer are not able to process a pre-miRNA substrate, a dsRNA with 2-nt 3'-overhangs, and a blunt-ended dsRNA. However, the PAZ deletion variants exhibit both RNase and DNase activity on short single-stranded RNA and DNAs, respectively. Collectively, our results indicate that when the PAZ domain is absent, other hDicer domains may contribute to substrate binding and in this case, non-canonical products can be generated.