ヒトおよびマウスのB細胞サブ集団におけるシグナル伝達研究のためのホスホフロープロトコル

Phosphoflow Protocol for Signaling Studies in Human and Murine B Cell Subpopulations.

• Jasper Rip
• Marjolein J W de Bruijn
• Allard Kaptein
• Rudi W Hendriks
• Odilia B J Corneth

抄録

BCRシグナル伝達は、キナーゼ、リパーゼ、リンカーを含む様々な下流分子のリン酸化に関与しており、B細胞の選択、生存、増殖、分化に重要な役割を果たしています。ホスホフローサイトメトリー（ホスホフロー）は、細胞内のリン酸化されたタンパク質を測定する単細胞ベースの手法であり、ウエスタンブロッティングよりも定量的に読み取ることができます。最近のホスホフローの進歩により、基本的には、事前の細胞ソーティングを行わずに、B細胞（サブ）集団内のタンパク質のリン酸化を同時に分析することが可能になりました。しかし、ホスホフローに必要な固定化や透過化の手順は、多くの場合、細胞表面のエピトープやmAbコンジュゲートに影響を与えるため、単一のサンプル中に存在する異なるB細胞サブ集団全体のシグナル伝達タンパク質のリン酸化状態を評価することはできません。この研究では、我々は、新鮮な単離または凍結細胞懸濁液から開始して、ヒト末梢血またはマウスの様々な解剖学的コンパートメントのB細胞サブ集団の広範な染色を可能にする汎用性の高いphosphoflowプロトコルを報告します。ヒトおよびマウスの両方のB細胞サブポピュレーションは、下流のシグナル伝達タンパク質の基底およびBCR刺激誘発性リン酸化レベルが異なることを示した。例えば、腹膜B-1細胞および脾臓限界帯B細胞は、それぞれ腹膜B-2細胞および脾臓濾胞B細胞と比較して、基底（ex vivo）シグナル伝達の有意な増加およびin vitroのBCR刺激に対する応答性の増加を示した。さらに、抗IgMまたは抗IgκL鎖Absによる刺激が強いpCD79aおよびpPLCγ2シグナルをもたらしたのに対し、IgD刺激はCD79aのみを誘導するが、pPLCγ2リン酸化は誘導しなかった。まとめると、このプロトコルは使いやすく、個々のB細胞の発生および分化段階を識別するための広範な染色と組み合わせて、単細胞レベルで高感度にBCR媒介のリン酸化を定量することができます。

BCR signaling, involving phosphorylation of various downstream molecules, including kinases, lipases, and linkers, is crucial for B cell selection, survival, proliferation, and differentiation. Phosphoflow cytometry (phosphoflow) is a single-cell-based technique to measure phosphorylated intracellular proteins, providing a more quantitative read-out than Western blotting. Recent advances in phosphoflow basically allow simultaneous analysis of protein phosphorylation in B cell (sub)populations, without prior cell sorting. However, fixation and permeabilization procedures required for phosphoflow often affect cell surface epitopes or mAb conjugates, precluding the evaluation of the phosphorylation status of signaling proteins across different B cell subpopulations present in a single sample. In this study, we report a versatile phosphoflow protocol allowing extensive staining of B cell subpopulations in human peripheral blood or various anatomical compartments in the mouse, starting from freshly isolated or frozen cell suspensions. Both human and mouse B cell subpopulations showed different basal and BCR stimulation-induced phosphorylation levels of downstream signaling proteins. For example, peritoneal B-1 cells and splenic marginal zone B cells exhibited significantly increased basal (ex vivo) signaling and increased responsiveness to in vitro BCR stimulation compared with peritoneal B-2 cells and splenic follicular B cells, respectively. In addition, whereas stimulation with anti-IgM or anti-Igκ L chain Abs resulted in strong pCD79a and pPLCγ2 signals, IgD stimulation only induced CD79a but not pPLCγ2 phosphorylation. In summary, the protocol is user friendly and quantifies BCR-mediated phosphorylation with high sensitivity at the single-cell level, in combination with extensive staining to identify individual B cell development and differentiation stages.

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