低温電子顕微鏡グリッドへの試料堆積：スプレーからジェットまで、そしてその逆まで

Sample deposition onto cryo-EM grids: from sprays to jets and back.

• David P Klebl
• Diana C F Monteiro
• Dimitrios Kontziampasis
• Florian Kopf
• Frank Sobott
• Howard D White
• Martin Trebbin
• Stephen P Muench

抄録

一粒子低温電子顕微鏡(クライオEM)の分野では、顕微鏡設計、直接電子検出器、新しい処理装置などの分野で大きな進歩が見られますが、試料前処理の分野はまだ理想的とは程遠いものです。従来、試料前処理にはブロッティングが含まれており、特にアポフェリチンのような挙動の良い試料では、高分解能を達成するために使用されてきました。しかし、この方法は、ブロッティングプロセスが一部のタンパク質やタンパク質複合体に悪影響を及ぼす可能性があり、ブロット時間が長いために、損傷を与える空気と水の界面にさらされる可能性が高くなるという欠陥がある。これらの問題を克服するために、グリッド上にサンプルを直接沈着させるための新しいブロットレスアプローチが設計されてきた。ここでは、サンプル堆積のための液滴を生成する異なる方法が比較されています。ガスダイナミックバーチャルノズルを用いて、微小で高速の液滴を低温電子顕微鏡グリッド上に堆積させ、高分解能の低温電子顕微鏡イメージングのために十分に広がるようにした。同様のアプローチを希望される方のために、現在のクライオ電子顕微鏡グリッド作製のためのスプレー技術の概要を説明し、強化すべき点を指摘しました。さらに、噴霧器の設計と操作条件の幅広い側面が、再現性の高いグリッド品質を向上させるためにどのように活用できるかを示しています。

Despite the great strides made in the field of single-particle cryogenic electron microscopy (cryo-EM) in microscope design, direct electron detectors and new processing suites, the area of sample preparation is still far from ideal. Traditionally, sample preparation involves blotting, which has been used to achieve high resolution, particularly for well behaved samples such as apoferritin. However, this approach is flawed since the blotting process can have adverse effects on some proteins and protein complexes, and the long blot time increases exposure to the damaging air-water interface. To overcome these problems, new blotless approaches have been designed for the direct deposition of the sample on the grid. Here, different methods of producing droplets for sample deposition are compared. Using gas dynamic virtual nozzles, small and high-velocity droplets were deposited on cryo-EM grids, which spread sufficiently for high-resolution cryo-EM imaging. For those wishing to pursue a similar approach, an overview is given of the current use of spray technology for cryo-EM grid preparation and areas for enhancement are pointed out. It is further shown how the broad aspects of sprayer design and operation conditions can be utilized to improve grid quality reproducibly.

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