PKGとAktの活性化はラメルテオン誘発前処理による心保護に必要であり、mKCaチャネルの上流に位置している

Activation of PKG and Akt Is Required for Cardioprotection by Ramelteon-Induced Preconditioning and Is Located Upstream of mKCa-Channels.

• Carolin Torregroza
• Osameh Jalajel
• Annika Raupach
• Katharina Feige
• Sebastian Bunte
• André Heinen
• Alexander Mathes
• Markus W Hollmann
• Ragnar Huhn
• Martin Stroethoff

抄録

ラメルテオンは、メラトニン1（MT1）およびメラトニン2（MT2）受容体アゴニストであり、薬理学的な前処理により心筋保護作用を付与する。この心保護作用にはミトコンドリアのカルシウム感受性カリウム（mK）チャネルの活性化が関与しているが、ラメルテオン誘発心保護作用の具体的な上流のシグナル伝達経路は不明である。本研究では、(1) ラメルテオン誘発心保護にプロテインキナーゼ G（PKG）やプロテインキナーゼ B（Akt）の活性化が関与しているかどうかを検討し、(2) ラメルテオン誘発前処理のシグナル伝達経路における PKG と Akt の正確な配列を決定した。雄性ウィスターラットの心はランダム化され、80 mmHgの一定圧力でKrebs-Henseleit緩衝液で灌流Langendorffシステム上に配置した。すべての心臓は、グローバル虚血の33分と再灌流の60分を受けた。虚血の前に、心臓を、ＰＫＧまたはＡＫＴ阻害剤ＫＴ５８２３およびＭＫ２２０６（ＫＴ５８２３＋ラム、ＫＴ５８２３、ＭＫ２２０６＋ラム、ＭＫ２２０６）の存在下で、または存在下で、それぞれＲａｍｅｌｔｅｏｎ（ラム）で灌流した。正確なシグナル伝達配列を決定するために、グアニル酸シクラーゼ活性化剤ＢＡＹ６０-２７７０およびｍＫチャネル活性化剤ＮＳ１６１９を用いて、その後の実験を行った。梗塞サイズは、2,3,5,5-トリフェニルテトラゾリウムクロライド（TTC）染色により決定した。ラメルテオンにより誘発された梗塞サイズの減少は、KT5823（＝0.0012）およびMK2206（＝0.0005）により完全に遮断された。MK2206とラメルテオンとBAY60-2770を併用した場合、心筋梗塞サイズは有意に減少した（＝0.0014）が、PKGの活性化はAktの後に起こることが示された。RamelteonとKT5823（＝0.0063）またはMK2206（＝0.006）をNS1619と併用した場合も梗塞サイズを有意に減少させたが、これはPKGとAktがmKチャネルの上流に位置していることを示している。今回の研究により、ラメルテオン誘発の前処理には、(1)PKGとAktの活性化が関与していること、(2)PKGはAktの下流に位置していること、(3)両酵素がシグナル伝達経路のmKチャネルの上流に位置していることが初めて明らかになった。

Ramelteon is a Melatonin 1 (MT1)-and Melatonin 2 (MT2)-receptor agonist conferring cardioprotection by pharmacologic preconditioning. While activation of mitochondrial calcium-sensitive potassium (mK)-channels is involved in this protective mechanism, the specific upstream signaling pathway of Ramelteon-induced cardioprotection is unknown. In the present study, we (1) investigated whether Ramelteon-induced cardioprotection involves activation of protein kinase G (PKG) and/or protein kinase B (Akt) and (2) determined the precise sequence of PKG and Akt in the signal transduction pathway of Ramelteon-induced preconditioning. Hearts of male Wistar rats were randomized and placed on a Langendorff system, perfused with Krebs-Henseleit buffer at a constant pressure of 80 mmHg. All hearts were subjected to 33 min of global ischemia and 60 min of reperfusion. Before ischemia, hearts were perfused with Ramelteon (Ram) with or without the PKG or Akt inhibitor KT5823 and MK2206, respectively (KT5823 + Ram, KT5823, MK2206 + Ram, MK2206). To determine the precise signaling sequence, subsequent experiments were conducted with the guanylate cyclase activator BAY60-2770 and the mK-channel activator NS1619. Infarct size was determined by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining. Ramelteon-induced infarct size reduction was completely blocked by KT5823 ( = 0.0012) and MK2206 ( = 0.0005). MK2206 with Ramelteon combined with BAY60-2770 reduced infarct size significantly ( = 0.0014) indicating that PKG activation takes place after Akt. Ramelteon and KT5823 ( = 0.0063) or MK2206 ( = 0.006) respectively combined with NS1619 also significantly reduced infarct size, indicating that PKG and Akt are located upstream of mK-channels. This study shows for the first time that Ramelteon-induced preconditioning (1) involves activation of PKG and Akt; (2) PKG is located downstream of Akt and (3) both enzymes are located upstream of mK-channels in the signal transduction pathway.