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乾燥血液斑からの5つの原発性免疫不全症の診断とスクリーニングのための多重化プロテオミクス分析
Multiplexed Proteomic Analysis for Diagnosis and Screening of Five Primary Immunodeficiency Disorders From Dried Blood Spots.
PMID: 32296420 PMCID: PMC7141245. DOI: 10.3389/fimmu.2020.00464.
抄録
原発性免疫不全症（PIDD）の早期発見は、効果的な治療と疾患管理のために最も重要である。新生児期の乾燥血液斑（DBS）から患者を同定することができれば、多くのPIDDは新生児スクリーニング（NBS）の有力な候補となるであろう。先天性PIDDの大部分は特定のタンパク質が減少または欠失しているため、これらの標的タンパク質の直接定量化は魅力的なスクリーニングツールとなる可能性を秘めています。しかし残念なことに、血球中のタンパク質濃度が非常に低く、DBSでは血液量が限られているため、検出には限界があります。我々は最近、選択反応モニタリング（イムノ-ＳＲＭ）と結合したペプチドイムノアフィニティ濃縮を用いて、ＰＩＤＤＳのためのＤＢＳ中の低アバンダンスタンパク質を定量するための新しい方法を開発しました。ここではさらに、DBSから5つのPIDD特異的タンパク質と2つの細胞型特異的タンパク質を代表する8つのシグネチャーペプチドの同時スクリーニングのための多重化イムノ-SRMパネルを生成しました。2名の保因者を含む28名のPIDD患者から得られたサンプルにおいて、X-Linked Agammaglobululinemia（XLA）、Wiskott-Aldrich Syndrome（WAS）、X-Linked Chronic Granulomatous Disease（XL-CGD）、DOCK8欠損症、ADA欠損症を代表するペプチドは正常対照と比較して有意に減少しており、患者同定は臨床および分子診断と優れた一致を示した。また、マルチプレックスパネルには、血小板（CD42）とナチュラルキラー細胞（CD56）の細胞特異的マーカーも含まれています。WAS患者では、CD42レベルが有意に低下しており、特徴的な血小板減少症を示しています。骨髄移植前後のWAS患者では、治療後にWASタンパク質と血小板CD42が正常化しており、PIDD治療の効果をモニターするためのイムノ-SRMの能力を強調しています。このアッセイは、2つの異なる研究室で容易に再現され、同様の分析性能と患者診断の完全な一致が得られたことから、標準化された方法が効果的であることが実証されました。本報告書では、大量の NBS ワークフローの要件を満たす 2.5 分間の実行時間で PIDD 固有のペプチドをスクリーニングするハイスループット Immuno-SRM 法も実証されています。このハイスループット法は、標準的なImmuno-SRMのPIDDパネルと同じ結果をもたらしました。Immuno-SRMペプチド分析は、容易に収集・出荷されたDBSからPIDD患者を同定し、研究するための堅牢な臨床診断法であり、新生児スクリーニングによる早期PIDD診断への大きな可能性を示しています。
Early detection of Primary Immunodeficiencies Disorders (PIDDs) is of paramount importance for effective treatment and disease management. Many PIDDs would be strong candidates for newborn screening (NBS) if robust screening methods could identify patients from dried blood spots (DBS) during the neonatal period. As majority of congenital PIDDs result in the reduction or absence of specific proteins, direct quantification of these target proteins represents an attractive potential screening tool. Unfortunately, detection is often limited by the extremely low protein concentrations in blood cells and limited blood volume present in DBS. We have recently developed a robust novel method for quantification of low abundance proteins in DBS for PIDDs using peptide immunoaffinity enrichment coupled to selected reaction monitoring (immuno-SRM). Here, we further generated a multiplexed Immuno-SRM panel for simultaneous screening of eight signature peptides representing five PIDD-specific and two cell-type specific proteins from DBS. In samples from 28 PIDD patients including two carriers, representing X-Linked Agammaglobulinemia (XLA), Wiskott-Aldrich Syndrome (WAS), X-Linked Chronic Granulomatous Disease (XL-CGD), DOCK8 Deficiency and ADA deficiency, peptides representing each disease are significantly reduced relative to normal controls and patient identification had excellent agreement with clinical and molecular diagnosis. Also included in the multiplex panel are cell specific markers for platelets (CD42) and Natural Killer Cells (CD56). In patients with WAS, CD42 levels were found to be significantly reduced consistent with characteristic thrombocytopenia. A patient with WAS analyzed before and after bone marrow transplant showed normalized WAS protein and platelet CD42 after treatment highlighting the ability of immuno-SRM to monitor the effects of PIDD treatment. The assay was readily reproduced in two separate laboratories with similar analytical performance and complete agreement in patient diagnosis demonstrating the effective standardized methods. A high-throughput Immuno-SRM method screens PIDD-specific peptides in a 2.5-min runtime meeting high volume NBS workflow requirements was also demonstrated in this report. This high-throughput method returned identical results to the standard Immuno-SRM PIDD panel. Immuno-SRM peptide analysis represents a robust potential clinical diagnostic for identifying and studying PIDD patients from easily collected and shipped DBS and supports a significant potential for early PIDD diagnosis through newborn screening.
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