最適化されたHITS-CLIP法を用いた核細胞質シャトリングRNA結合タンパク質HNRNPUの解析

Analysis of the nucleocytoplasmic shuttling RNA-binding protein HNRNPU using optimized HITS-CLIP method.

• Masato Yugami
• Hideyuki Okano
• Atsushi Nakanishi
• Masato Yano

抄録

RNA 結合タンパク質（RBP）は、標的 RNA に直接結合することにより、mRNA スプライシング、mRNA の安定性、翻訳効率など、多くの転写後制御を行っており、その変異や機能不全は、多くの場合、ヒトの神経疾患や腫瘍性疾患と関連しています。架橋免疫沈降法（CLIP）とハイスループットシーケンシング（HITS-CLIP）は、RBPの標的配列をトランスクリプトームレベルで網羅的に同定することにより、疾患発症の分子機構を解明するための強力な手法である。しかし、HITS-CLIPのプロトコルは、実験の複雑さ、効率の低さ、時間がかかること、少量のRNAからライブラリーを作成しなければならないことなどから、最適化が求められています。ここで我々は、BrdU-CLIPを最適化することで、より効率的で迅速かつ再現性の高いCLIP法を改良した。我々のプロトコルは、事前増幅されたCLIPライブラリの収率が10倍になり、ライブラリの増幅に必要なPCRサイクル数が減少したため、CLIPタグリードの重複率が低くなりました。また、収率のばらつきも小さくなり、実験期間を2日短縮することができました。これを用いて、核内RBPであるHNRNPUによってIL-6の発現を検証したが、これはHeLa細胞におけるIL-6 mRNAの3'-UTRに直接結合する。重要なことに、この相互作用は細胞質画分でのみ観察されたことから、mRNAの安定性制御における細胞質HNRNPUの役割が示唆された。この最適化された方法により、標的遺伝子を正確に同定することが可能となり、核細胞質シャトリングRBPのタンパク質-RNA相互作用のスナップショットが得られる。

RNA-binding proteins (RBPs) control many types of post-transcriptional regulation, including mRNA splicing, mRNA stability, and translational efficiency, by directly binding to their target RNAs and their mutation and dysfunction are often associated with several human neurological diseases and tumorigenesis. Crosslinking immunoprecipitation (CLIP), coupled with high-throughput sequencing (HITS-CLIP), is a powerful technique for investigating the molecular mechanisms underlying disease pathogenesis by comprehensive identification of RBP target sequences at the transcriptome level. However, HITS-CLIP protocol is still required for some optimization due to experimental complication, low efficiency and time-consuming, whose library has to be generated from very small amounts of RNAs. Here we improved a more efficient, rapid, and reproducible CLIP method by optimizing BrdU-CLIP. Our protocol produced a 10-fold greater yield of pre-amplified CLIP library, which resulted in a low duplicate rate of CLIP-tag reads because the number of PCR cycles required for library amplification was reduced. Variance of the yields was also reduced, and the experimental period was shortened by 2 days. Using this, we validated IL-6 expression by a nuclear RBP, HNRNPU, which directly binds the 3'-UTR of IL-6 mRNA in HeLa cells. Importantly, this interaction was only observed in the cytoplasmic fraction, suggesting a role of cytoplasmic HNRNPU in mRNA stability control. This optimized method enables us to accurately identify target genes and provides a snapshot of the protein-RNA interactions of nucleocytoplasmic shuttling RBPs.