流体力学的注入システムを用いたマウス脂肪原性炎症介在性肝癌モデルの確立

[Establishment of mouse lipogenic inflammation-mediated hepatocarcinoma model by hydrodynamic injection system].

• Yitong Lu
• Jiameng Yang
• Junlong Zhao
• Hongyan Qin

抄録

目的 プロテインキナーゼB（AKT）、β-カテニン、およびスリーピングビューティートランスポゾンプラスミドを尾静脈を介して肝細胞に流体力学的にトランスフェクションすることにより、マウス脂肪原性炎症介在性肝がんモデルを確立し、評価する。方法 等張性生理活性溶液（20μg myrAKT、20μg δN90-β-カテニン、4μｇのスリーピングビューティートランスポザーゼを通常の生理食塩水２ｍＬに溶解したもの）を６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄マウスに尾静脈を介して流体力学的トランスフェクションにより短時間（５〜９秒）で注入し、対照プラスミドを同様の方法で注入した。次いで、これらのプラスミドの注入後８、１２、または１６週齢のマウスを犠牲にし、その血清および肝臓組織を採取した。さらなる分析のためにRNAサンプルを抽出した。HE染色は肝組織の構造および炎症性細胞の浸潤を検出するために使用された；オイルレッドO染色は肝細胞における脂質沈着を調べるために使用された；シリウスレッドおよびマッソン染色は肝組織におけるコラーゲン沈着を識別するために使用された；免疫組織化学は細胞の増殖能力および微小血管の密度および分布を評価するために実施された；リアルタイム定量PCRは腫瘍関連遺伝子の発現を反映するために使用された；フローサイトメトリーは免疫細胞の表現型の同定のために使用された。結果 流体力学的トランスフェクションの16週間後、実験群では100% (20/20) のマウスに肝腫瘍が発生した。対照群と比較して、実験群のマウスの体重はゆっくりと増加し、肝臓の質量は有意に増加した。HE染色では、肝細胞の多くがステアトーシスを呈し、炎症性細胞の浸潤が増加し、肝腫瘍細胞は円形または不定形で、細胞質比が不均衡で、腫瘍細胞の異型性が明らかで、腫瘍細胞がクラスタリングして分布していた；ki67陽性細胞が増強されていた。血清アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（AST）、γ-グルタミルトランスペプチダーゼ（γ-GT）、アルカリホスファターゼ（ALP）が著しく上昇した。AFP mRNAも肝臓組織で有意に増加した。CD31染色では血管密度の増加と血管構造の乱れが認められた。肝組織には多数の炎症性細胞、特にミエロイド細胞とリンパ球細胞が浸潤していた。結論 AKT と β-カテニンプラスミドを用いた流体力学的トランスフェクションにより、非解離性炎症に起因する紫 臓脂肪原性炎症介在性肝癌モデルを確立することに成功した。この方法は、実行が容易で再現性が高く、腫瘍形成率が高く、誘導時間が比較的短い。

Objective To establish and evaluate a murine lipogenic inflammation-mediated hepatocarcinoma model with hydrodynamic transfection of protein kinase B (AKT), β-catenin, and Sleeping Beauty transposon plasmids into hepatocytes through the tail vein. Methods Isotonic physiological solution (20 μg myrAKT, 20 μg δN90-β-catenin and 4 μg Sleeping Beauty transposase were dissolved in 2 mL of normal saline) was injected into C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks via the tail vein in a short period of time (5-9 s) by hydrodynamic transfection, while the control plasmid was injected with the same method. Mice were then sacrificed 8, 12, or 16 weeks after the injection of these plasmids, and their serum and liver tissues were collected. RNA samples were extracted for further analysis. HE staining was used to detect liver tissue structure and inflammatory cell infiltration; oil red O staining was used to examine lipid deposition in liver cells; sirius red and Masson staining were used to identify collagen deposition in liver tissues; immunohistochemistry was performed to evaluate the proliferation abilities of the cells and microvascular density and distribution; real-time quantitative PCR was used to reflect the expression of tumor-associated genes; flow cytometry was used for immune cell phenotype identification. Results Sixteen weeks after hydrodynamic transfection, 100% (20/20) mice developed liver tumors in the experimental group. Compared with the control group, the body mass of mice in the experimental group increased slowly and liver mass increased significantly. HE staining showed that a large number of hepatocytes appeared to be steatosis, inflammatory cell infiltration increased, liver tumor cells were round or irregular-shaped, the cytoplasmic ratio was imbalanced, tumor cell atypia was obvious and tumor cells were distributed in clustering; ki67 positive cells were enhanced. Serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), γ-glutamyl transpeptidase (γ-GT), and alkaline phosphatase (ALP) levels remarkably increased. AFP mRNA also significantly increased in liver tissue. CD31 staining showed increased vessel density and vessel structure disorganization. A large number of inflammatory cells, especially myeloid and lymphoid cells, were infiltrated into the liver tissue. Conclusion Murine lipogenic inflammation-mediated hepatocarcinoma model that is caused by non-resolving inflammation was successfully established by hydrodynamic transfection with AKT and β-catenin plasmids. This method is easier performed and reproducible, the induction time is relatively short with a high rate of tumor formation.