MinIONとイルミナシーケンサーを用いて中国でヒトアデノウイルスサブタイプ21aを初めて同定

First Identification of Human Adenovirus Subtype 21a in China With MinION and Illumina Sequencers.

• Fuqiang Ye
• Yifang Han
• Juanjuan Zhu
• Peng Li
• Qi Zhang
• Yanfeng Lin
• Taiwu Wang
• Heng Lv
• Changjun Wang
• Chunhui Wang
• Jinhai Zhang

抄録

ヒトアデノウイルス（HAdV）は、子供から大人まで様々な疾患を引き起こすことが実証されています。ヒトアデノウイルス 21 型 (HAdV21) の循環は、主にいくつかの国の閉鎖的な環境下で記録されています。しかし、中国ではHAdV21による呼吸器感染症やアウトブレイクは報告されていません。喉の綿棒から潜在的な病原体を同定するために、MinIONとIlluminaのプラットフォームを使用した。MinIONとIlluminaのシーケンシング間の不一致は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって検証され、修正された。その後、ゲノムの特徴付けと組換えイベントの検出が行われた。35,466の高品質のMinIONリードのうち、合計5,999リード（16.91％）がHAdV21リファレンスゲノム（ゲノムサイズ≒35.3kb）にアラインメントされ、そのうち20リードは30kb以上の長さを持っていました。MinIONのリードから組み立てられたゲノム配列は、さらにHAdVサブタイプ21aとして分類された。ランダムダウンサンプリングの結果、500個のナノポアリードで現在のゲノムの96.49％以上をカバーできることが判明した。イルミナシーケンシングはMinIONシーケンシングと良好な整合性（ペアワイズヌクレオチド同一性＝99.91％）を示したが、31の不一致があり、これらの不一致はさらに検証され、PCRとSangerシーケンシングとの結合によって確認された。HIやIなどの制限酵素を用いて、本ゲノムをHAdV21プロトタイプやHAdV21bと区別することができた。全ゲノム配列を用いた系統解析の結果、本ゲノムはサブタイプ21aのみのメンバーであることが判明した。HAdV21a株に共通する特徴として、ペントンおよび100kDaヘキソンアセンブリ関連タンパク質の多型、およびE4遺伝子の組換え事象が確認された。MinION と Illumina シークエンサーを用いて、中国初の HAdV21a 株を同定しました。この株は、疾病管理や疫学調査のための重要なゲノムデータを提供する可能性があります。

Human adenoviruses (HAdVs) have been demonstrated to cause a diversity of diseases among children and adults. The circulation of human adenovirus type 21 (HAdV21) has been mainly documented within closed environments in several countries. Nonetheless, respiratory infections or outbreaks due to HAdV21 have never been reported in China. MinION and Illumina platforms were employed to identify the potential pathogen from a throat swab. Discrepancies between MinION and Illumina sequencing were validated and corrected via polymerase chain reaction (PCR). Genomic characterization and recombinant event detection were then performed. Among the 35,466 high-quality MinION reads, a total of 5,999 reads (16.91%) could be aligned to HAdV21 reference genomes (genome sizes ≈35.3 kb), among which 20 had a length of >30 kb. A genome sequence assembled from MinION reads was further classified as HAdV subtype 21a. Random downsampling revealed as few as 500 nanopore reads could cover ≥96.49% of current genome. Illumina sequencing displayed good consistency (pairwise nucleotide identity = 99.91%) with MinION sequencing but with 31 discrepancies that were further validated and confirmed by PCR coupled with Sanger sequencing. Restriction enzymes such as HI and I were able to distinguish the present genome from HAdV21 prototype and HAdV21b. Phylogenetic analysis employing whole-genome sequences placed our genome with members only from subtype 21a. Common features among HAdV21a strains were identified, including polymorphisms discovered in penton and 100 kDa hexon assembly-associated proteins and a recombinant event in the E4 gene. Using MinION and Illumina sequencers, we identified the first HAdV21a strain from China, which could provide key genomic data for disease control and epidemiological investigations.

Copyright © 2020 Ye, Han, Zhu, Li, Zhang, Lin, Wang, Lv, Wang, Wang and Zhang.