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リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いたキネトプラスチジア種の人獣共通感染症の鑑別診断アルゴリズム
Real-time polymerase chain reaction based algorithm for differential diagnosis of Kinetoplastidean species of zoonotic relevance.
PMID: 32325192 DOI: 10.1016/j.meegid.2020.104328.
抄録
キネトプラスチッドは鞭毛を持つ原生動物の一群であり、哺乳類や昆虫のベクターに感染する膨大なレパートリーを有している。人獣共通感染症の観点から見ると、家畜はキネトプラスチッド原虫の感染源として重要な存在である。家畜は人に近いため、これらの動物は、これらの人獣共通感染症、ひいては公衆衛生の観点から、疫学的に重要な存在である。これらの寄生虫を確実に同定することは、感染サイクルにおける環境疫学的な関与を理解する上で重要である。本研究の目的は、哺乳類のリザーバーおよびトライアトミンベクターから採取した生物学的サンプル中のTrypanosoma cruzi、Trypanosoma rangeli、Trypanosoma evansi、およびLeishmania種を区別できるように、異なる遺伝子座（24S alpha rDNA、ITS1、およびHsp70）を標的としたシーケンシャルリアルタイムPCR（qPCR）アッセイに基づくアルゴリズムを開発することであった。このアルゴリズムは、ＤＮＡサンプルの完全性および／またはｑＰＣＲ阻害の内部コントロールとして、哺乳類およびトリアトミンベクター内で保存されている内因性遺伝子を標的とした第１のｑＰＣＲ試験を含む。このアルゴリズムは、家畜ウシ（N=14）、イヌ（N=19）およびトリアトミン（N=19）からの生物学的サンプルにおいて評価された。T. rangeli の検出に対する 24S α rDNA の分析感度は DNA の 10fg であり、10fg から 10ng の間の直線的な範囲であった。T. cruziについては、Discrete typing unitに依存して変動した。ITS1 qPCRは、Leishmania spp.とT. evansiのDNAについて、100pg/反応、100fg/反応の分析感度を示した。哺乳類のフィールドサンプルでは、4つのT. cruzi 24S alpha rDNA配列と14個のT. evansiに特異的なITS1アンプリコンが検出された。トリアトミンフィールドで採取した19検体のうち、T. cruziは5検体、T. rangeliは8検体で検出され、1検体は混合感染を示した。この診断アルゴリズムにより，ベクターやリザーバーにおけるキネトプラスチド感染症の感染負荷をより正確に記録することが可能となり，現在の共蔓性地域の生態疫学的マップを更新することが可能となった．
Kinetoplastids are a group of flagellated protozoa that infect a vast repertoire of mammals and insect vectors. From a zoonotic point of view, domestic animals are critical reservoirs for transmission of Kinetoplastidean parasites. Due to their proximity to humans, they assume substantial epidemiological importance in the context of these zoonoses and consequently in public health. Their reliable identification is relevant to understand their eco-epidemiological involvement in transmission cycles. This work aimed to develop an algorithm based on sequential Real-Time PCR (qPCR) assays targeted to different loci (24S alpha rDNA, ITS1 and Hsp70) allowing distinction among Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma evansi and Leishmania species in biological samples collected from mammalian reservoirs and triatomine vectors. The algorithm includes a first qPCR test targeted to endogenous genes conserved within mammals and within triatomine vectors as internal controls of DNA sample integrity and/or qPCR inhibition. This algorithm was evaluated in biological samples from domestic cattle (N = 14), dogs (N = 19) and triatomines (N = 19). Analytical sensitivity of 24S alpha rDNA for detection of T. rangeli was 10 fg of DNA, with a linear range between 10 fg and 10 ng. For T. cruzi it varied depending on the Discrete typing unit. The ITS1 qPCR showed an analytical sensitivity of 100 pg/reaction and 100 fg/reaction of Leishmania spp. and T. evansi DNAs. In mammal field samples, four T. cruzi 24S alpha rDNA sequences and fourteen ITS1 amplicons specific for T. evansi were detected. qPCR-HRM analysis directed to the Hsp70 gene diagnosed two dogs with Leishmania infantum infection. Among 19 triatomine field samples, T. cruzi was detected in five; T. rangeli in eight and one specimen showed a mixed infection. This diagnostic algorithm can provide more accurate records of kinetoplastidean infection burden in vectors and reservoirs, relevant to update current eco-epidemiological maps in co-endemic regions.
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