日本語AIでPubMedを検索
液胞体ATPase枯渇はトリパノソーマ・ブルセイの血流型におけるエンドサイトーシスの調節障害に寄与している
Vacuolar ATPase depletion contributes to dysregulation of endocytosis in bloodstream forms of Trypanosoma brucei.
PMID: 32334612 PMCID: PMC7183646. DOI: 10.1186/s13071-020-04068-4.
抄録
背景:
液胞H-ATPase（V-ATPase）は、ATPを加水分解し、プロトンをポンプで液胞を酸性化する高度に保存されたタンパク質複合体である。V-ATPaseのエンドサイトーシスへの関与は哺乳類や植物ではよく知られていますが、トリパノソーマ・ブルセイではあまり明らかにされていません。
BACKGROUND: Vacuolar H-ATPase (V-ATPase) is a highly conserved protein complex which hydrolyzes ATP and pumps protons to acidify vacuolar vesicles. Beyond its role in pH maintenance, the involvement of V-ATPase in endocytosis is well documented in mammals and plants but is less clear in Trypanosoma brucei.
方法:
本研究では、T. brucei の V-ATPase subunit B (TbVAB) の細胞内局在を in situ N 末端 YFP タギングおよび免疫蛍光アッセイにより評価した。T. bruceiのトランスジェニック血流形態（BSF）は、V-ATPase subunit B（TbVAB）条件付きノックアウトまたはV-ATPase subunit A（TbVAA）ノックダウンのいずれかで構成された。BSF T. bruceiのpH調節におけるV-ATPaseの役割をアクリジンオレンジとBCECF-AMを用いて評価した。また、フローサイトメトリー解析により、3つのマーカーの内分泌活性を評価した。さらに、トリパノソームをトリパノライシス処理群（1％または5％NHSを含む）から計数し、エンドサイト化されたトリパノソーム融解因子（TLF）を免疫ブロッティングアッセイで分析した。
METHODS: In this study, the subcellular localization of V-ATPase subunit B (TbVAB) of T. brucei was assessed via in situ N-terminal YFP-tagging and immunofluorescence assays. Transgenic bloodstream forms (BSF) of T. brucei were generated which comprised either a V-ATPase subunit B (TbVAB) conditional knockout or a V-ATPase subunit A (TbVAA) knockdown. Acridine orange and BCECF-AM were employed to assess the roles of V-ATPase in the pH regulation of BSF T. brucei. The endocytic activities of three markers were also characterized by flow cytometry analyses. Furthermore, trypanosomes were counted from trypanolysis treatment groups (either containing 1% or 5% NHS) and endocytosed trypanosome lytic factor (TLF) was also analyzed by an immunoblotting assay.
結果:
TbVABはアシッドカルシソーム、リソソーム、そしておそらくT. bruceiのBSFのエンドソームに局在しており、細胞の成長に不可欠であることが明らかになった。TbVABの枯渇はテトラサイクリン枯渇の24時間後（hpd）に酸性小器官を中和し、細胞内pHは7.016±0.013から7.422±0.058に上昇した。24時間後にTbVABが枯渇したトリパノソームは、エンドサイトーシスによってトランスフェリン（2.068±0.277倍）をより多く取り込むが、トマトレクチン（49.31±22.57％）をより少なく取り込むことが見出されたが、デキストランの取り込みには有意な変化は見られなかった。同様のエンドサイトーシス異常表現型は、TbVAAノックダウン細胞においても観察された。さらに、TbVAB 枯渇トリパノソームは、TLF の取り込みが少なく、1％および 5％の NHS 処理では溶解に対する感受性が低かった。
RESULTS: TbVAB was found to localize to acidocalcisomes, lysosomes and probably also to endosomes of BSF of T. brucei and was demonstrated to be essential for cell growth. TbVAB depletion neutralized acidic organelles at 24 hours post-tetracycline depletion (hpd), meanwhile the steady state intracellular pH increased from 7.016 ± 0.013 to 7.422 ± 0.058. Trypanosomes with TbVAB depletion at 24 hpd were found to take up more transferrin (2.068 ± 0.277 fold) but less tomato lectin (49.31 ± 22.57%) by endocytosis, while no significant change was detected in dextran uptake. Similar endocytic dysregulated phenotypes were also observed in TbVAA knockdown cells. In addition, TbVAB depleted trypanosomes showed a low uptake of TLF and exhibited less sensitive to lysis in both 1% and 5% NHS treatments.
結論:
TbVABはV-ATPaseの重要な構成要素であり、エンドサイトーシスに重要な役割を果たし、T. bruceiのBSFでは受容体/輸送体に依存して異なる効果を示すことが明らかになった。液胞のアルカリ化に加えて、TbVAB 枯渇 T. brucei のエンドサイトーシスの調節障害は、正常なヒト血清による溶解感受性の低下に寄与していると考えられた。
CONCLUSIONS: TbVAB is a key component of V-ATPase and was found to play a key function in endocytosis as well as exhibiting different effects in a receptor/cargo dependent manner in BSF of T. brucei. Besides vacuolar alkalinization, the dysregulation of endocytosis in TbVAB depleted T. brucei is considered to contribute to the reduced sensitivity to lysis by normal human serum.