血小板の活性化に続く動的な細胞質カルシウム、ナトリウム、およびカリウムフラックスのフローサイトメトリーモニタリング

Flow Cytometric Monitoring of Dynamic Cytosolic Calcium, Sodium, and Potassium Fluxes Following Platelet Activation.

• Alessandro Aliotta
• Debora Bertaggia Calderara
• Lorenzo Alberio

抄録

血小板アゴニストとそれぞれの膜受容体との相互作用は、細胞内シグナル伝達を誘発するが、その中でも細胞内イオンフラックスは活性化過程において重要な役割を果たしている。血小板活性化における細胞間遊離カルシウムの重要な役割は認められているが、ナトリウムとカリウムの役割については、最近の研究ではあまり研究されていない。ここでは、血小板の活性化に伴う細胞質の遊離カルシウム、ナトリウム、カリウムのイオンフラックスを経時的にモニターするための新しいフローサイトメトリー法を導入し、特にナトリウムとカリウムに焦点を当てたイオン動態のリアルタイム可視化が可能であることを実証した。血小板には、選択的なイオンインジケータ、Fluo-3（Ca）、イオンNaTRIUM Green-2（Na）、およびイオンカリウムGreen-2（K）をロードしました。蛍光はフローサイトメトリーでモニターした。安定したベースラインを測定した後、血小板を活性化し、10分までの時間をかけてイオンインジケータ蛍光を取得した。血小板はトロンボキサンアナログ U46619、ADP、トロンビン、TRAP6（PAR-1 アゴニスト）、AYPGKF（PAR-4 アゴニスト）、コンブルキシン（コラーゲン受容体 GPVI アゴニスト）、またはそれらの組み合わせのいずれかで活性化した。このように、我々は、正確な方法を実現するために、分析前のパラメータ（特に色素負荷時間と濃度）を評価しました。その後、血小板アゴニストに対する細胞質カルシウム、ナトリウム、カリウムの動態を調べた。その結果、異なるパターンのアゴニストとの相乗効果が観察された。結論として、本研究では、フローサイトメトリーによる細胞質イオンモニタリングを用いて、血小板活性化後の特徴的なカルシウム、ナトリウム、カリウムの動員パターンを調べることに焦点を当てた。この簡単な手法は、異なる血小板亜集団におけるシグナル伝達を解析する新しい方法を切り開くものであり、血小板の病態生理を調査するのに有用であることが証明されるはずである。

The interaction of platelet agonists with their respective membrane receptors triggers intracellular signaling, among which cytosolic ion fluxes play an important role in activation processes. While the key contribution of intercellular free calcium is accepted, sodium and potassium roles in platelet activation have been less investigated in recent studies. Here, we implemented a novel flow-cytometric method to monitor over time cytosolic free calcium, sodium, and potassium ion fluxes upon platelet activation and we demonstrate the feasibility of real-time visualization of ion kinetics, in particular with a focus on sodium and potassium. Platelets were loaded with selective ion indicators, Fluo-3 (Ca ), ION NaTRIUM Green-2 (Na ), and ION Potassium Green-2 (K ). Fluorescence was monitored by flow cytometry. After measurement of a stable baseline, platelets were activated and ion indicator fluorescence was acquired over time, up to 10 min. Platelets were activated with either thromboxane analogue U46619, ADP, thrombin, TRAP6 (PAR-1 agonist), AYPGKF (PAR-4 agonist), convulxin (collagen receptor GPVI agonist), or combinations thereof. We evaluated preanalytical parameters (in particular dye loading time and concentration) to implement an accurate method. Subsequently, we characterized cytosolic calcium, sodium, and potassium kinetics in response to platelet agonists. We observed different patterns of agonist synergism. In conclusion, the present work highlights the use of cytosolic ion monitoring by flow cytometry to investigate characteristic calcium, sodium, and potassium mobilization patterns following platelet activation. This easy technique opens a new way to analyze signaling in different platelet subpopulations and it should prove useful for investigating platelet pathophysiology. © 2020 International Society for Advancement of Cytometry.

© 2020 International Society for Advancement of Cytometry.