BRAG2aはPSD-95およびエンドフィリン3との相互作用を介して興奮性ポストシナプスにおけるmGluR依存性AMPA受容体の内部化を媒介している

BRAG2a Mediates mGluR-Dependent AMPA Receptor Internalization at Excitatory Postsynapses through the Interaction with PSD-95 and Endophilin 3.

• Masahiro Fukaya
• Takeyuki Sugawara
• Yoshinobu Hara
• Makoto Itakura
• Masahiko Watanabe
• Hiroyuki Sakagami

抄録

Brefeldin A-resistant ArfGEF 2 (BRAG2) [またはIqsec1 (IQ motif and Sec7 domain-containing protein 1)]は、形質膜とエンドソーム間の膜トラフィッキングに関与する小型GTPaseであるADPリボシル化因子6 (Arf6)のグアニンヌクレオチド交換因子である。BRAG2は、海馬長期うつ状態の間、直接相互作用を介してAMPA受容体（AMPAR）のArf6依存性エンドサイトーシスを制御している。しかし、BRAG2-Arf6経路がAMPA受容体とエンドサイトーシス機構を結びつける分子機構は未だ解明されていない。ここでは、マウスの脳を用いて、プロリンを豊富に含むドメインとI型PDZ結合モチーフを含む長いC末端インサートを持つ代替アイソフォームであるBRAG2aが興奮性シナプス後密度（PSD）に選択的に局在していることを明らかにした。酵母の2ハイブリッ ドスクリーニングを用いて、脳内のBRAG2a結合パートナーとしてPSD-95とエンドフィリン1/3を同定した。PSD-95との相互作用は、BRAG2aのシナプス標的化に必要であった。培養海馬ニューロンでは、I群メタボトロピックグルタミン酸受容体（mGluR）を刺激すると、BRAG2aとエンドフィリン3との相互作用が時間依存的に増加し、それに伴ってArf6が活性化された。培養海馬ニューロンにおけるBRAG2のノックダウンは、表面AMPARレベルのmGluR依存性の低下をブロックした。この低下は、野生型BRAG2aを導入することで改善されたが、野生型BRAG2bやBRAG2a変異体は、Arf6を活性化したり、エンドフィリン3やPSD-95と相互作用したりする能力を欠いていた。また、BRAG2a、Arf6、エンドフィリン3がシナプス後膜で効率的にエンドサイトーシスを行うために、あらかじめ組織化された横方向の分布をしていることが明らかになった。以上の結果から、BRAG2aがPSD-95やエンドフィリン3との相互作用を介してAMPARとクラスリン依存性エンドサイトーシス経路を結びつける新しい分子機構が明らかになった。BRAG2/Iqsec1は、形質膜とエンドソーム間の膜輸送に関与する小型GTPaseであるADPリボシル化因子6（Arf6）のGDP/GTP交換因子であり、学習・記憶に関わるシナプス可塑性のメカニズムの一つである海馬長期抑圧時に直接相互作用して、AMPARのArf6依存性エンドサイトーシスを制御している。しかし、BRAG2-Arf6経路がAMPARとエンドサイトーシス機械系を結びつける分子機構は未だ解明されていない。本研究では、BRAG2が媒介するAMPARの内包化機構をアイソフォーム特異的に同定した。その結果、BRAG2aアイソフォームがPSD-95やエンドフィリン3と相互作用することで、海馬ニューロンの表面AMPARがmGluRに依存して減少することを明らかにした。これらの結果は、BRAG2がシナプス後のニューロンでAMPARをクラトリン媒介の内分泌系に結びつける新規な分子機構を明らかにしたものである。

Brefeldin A-resistant ArfGEF 2 (BRAG2) [or Iqsec1 (IQ motif and Sec7 domain-containing protein 1)] is a guanine nucleotide exchange factor for ADP ribosylation factor 6 (Arf6), a small GTPase implicated in the membrane trafficking between the plasma membrane and endosomes. BRAG2 regulates Arf6-dependent endocytosis of AMPA receptors (AMPARs) through the direct interaction during the hippocampal long-term depression. However, the molecular mechanism by which the BRAG2-Arf6 pathway links AMPARs to the endocytic machinery remains elusive. Herein, using mouse brains of both sexes, we demonstrated that BRAG2a, an alternative isoform with a long C-terminal insert containing a proline-rich domain and type I PDZ-binding motif, was selectively localized to the excitatory postsynaptic density (PSD). Using yeast two-hybrid screening, we identified PSD-95 and endophilin 1/3 as BRAG2a-binding partners in the brain. The interaction with PSD-95 was required for synaptic targeting of BRAG2a. In cultured hippocampal neurons, stimulation of group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) increased the interaction of BRAG2a with endophilin 3 and concomitant Arf6 activation in a time-dependent manner. Knockdown of BRAG2 in cultured hippocampal neurons blocked the mGluR-dependent decrease in surface AMPAR levels, which was rescued by introducing wild-type BRAG2a, but not wild-type BRAG2b or BRAG2a mutants lacking the ability to activate Arf6 or to interact with endophilin 3 or PSD-95. Further postembedding immunoelectron microscopic analysis revealed the preorganized lateral distribution of BRAG2a, Arf6, and endophilin 3 for efficient endocytosis at the postsynaptic membrane. Together, the present findings unveiled a novel molecular mechanism by which BRAG2a links AMPARs to the clathrin-dependent endocytic pathway through its interaction with PSD-95 and endophilin 3. BRAG2/Iqsec1 is a GDP/GTP exchange factor for ADP ribosylation factor 6 (Arf6), a small GTPase implicated in the membrane trafficking between the plasma membrane and endosomes, and regulates Arf6-dependent endocytosis of AMPARs through direct interaction during hippocampal long-term depression, one of the mechanisms of synaptic plasticity related to learning and memory. However, the molecular mechanism by which the BRAG2-Arf6 pathway links AMPARs to the endocytic machinery remains elusive. Here, we identified isoform-specific mechanisms of BRAG2-mediated AMPAR internalization. We demonstrated that the interaction of BRAG2a isoform with PSD-95 and endophilin 3 was required for the mGluR-dependent decrease in surface AMPARs in hippocampal neurons. These results unveiled a novel molecular mechanism by which BRAG2 links AMPARs to the clathrin-mediated endocytic machinery at postsynaptic sites.

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