培養ラット心筋細胞に対するアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖の遺伝子発現プロファイリングの解析

Analysis of gene expression profiling of amyloidogenic immunoglobulin light-chains on cultured rat cardiomyocytes.

• Fei Xu
• Yue Yu
• Fang Wang
• Wei Sun
• Peng Li
• Heng-Fang Wu
• Zhi-Ping Bian
• Xiang-Jian Chen
• Xu Dong-Jie

抄録

本研究は、異なるアミロイド原性免疫グロブリン軽鎖（LC）の心筋細胞に対する毒性効果を調査し、このプロセスに関与する異なる発現遺伝子（DEG）およびシグナル伝達経路を実証することを目的とした。培養した心筋細胞を、組換えκＬＣペプチド（ＡＬ-０９）または心臓病変を有する多発性骨髄腫（λＬＣ）と診断された患者からの血清で処理した。健康な患者からの６×Ｈｉｓペプチドまたは血清を、それぞれペプチド対照または血清対照として使用した。細胞生存率はCCK-8アッセイを用いて決定し、アポトーシスはフローサイトメトリーを用いて分析した。ＤＥＧは、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ-Ｓｅｑ）により検出し、その後、Ｇｅｎｅ ＯｎｔｏｌｏｇｙおよびＫｅｔｈｏｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）解析を行った。遺伝子発現レベルの変化は逆転写定量PCRにより確認した。AL-09ペプチド処理（0.2 mg/ml）および患者血清処理（1:10希釈）した心筋細胞の細胞生存率は、対応する対照群の42％および-72％に低下した。細胞のアポトーシスの程度は、対照群と比較してAL-09処理心筋細胞で増加した。RNA-Seqは、127のアップレギュレーションされた遺伝子と88のダウンレギュレーションされた遺伝子を含む256のDEGが2つのペアのグループに共存していることを示した。アップレギュレーションされた発現遺伝子のKEGG経路には、「TGF-βシグナル伝達経路」、「ヘッジホッグシグナル伝達経路」、「ErbBシグナル伝達経路」、「リジン分解」が含まれていた。また、骨形態形成タンパク質（プロスタグランジンG/H合成酵素、エピレグリン、プロコラーゲン-リジン、2-オキソグルタル酸5-ジオキシゲナーゼ2）のmRNA発現量が増加していることが確認された。ダウンレギュレーションされた発現遺伝子のKEGG経路には、「p53シグナル伝達経路」と「細胞周期」に関与する遺伝子が含まれていた。E3 ユビキチンプロテインリガーゼ CCNB1IP1 の mRNA 発現レベルは、AL-09 ペプチド群では、6xHis ペプチド群と比較して有意なダウンレギュレーションを示した。結論として、アミロイド原性λおよびκＬＣで処理した心筋細胞は、対照群と比較して細胞生存率の低下を呈した。細胞のアポトーシスは、対照と比較してκLCで処理した細胞で増加した。また，トランスフォーミング成長因子β-骨形態形成タンパク質，受容体チロシンプロテインキナーゼerbB-2シグナル伝達経路，プロスタグランジン，コラーゲン産生，p53シグナル伝達経路，細胞周期に関連する遺伝子発現プロファイルは，軽鎖処理した心筋細胞で変化した。

The present study aimed to investigate the toxic effects of different amyloidogenic light-chains (LCs) on cardiomyocytes, and demonstrate the differentially expressed genes (DEGs) and signaling pathways that participate in this process. Cultured cardiomyocytes were treated with recombinant κ LC peptide (AL-09) or with serum from a patient diagnosed with multiple myeloma (λ LC) with cardiac involvement. The 6xHis peptide or serum from healthy patients was used as peptide control or serum control, respectively. Cell viability was determined using CCK-8 assay and apoptosis was analyzed by flow cytometry. The DEGs were detected by RNA sequencing (RNA-Seq), followed by Gene Ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analyses. Changes in gene expression levels were confirmed by reverse transcription-quantitative PCR. The cell viability in the AL-09 peptide-treated (0.2 mg/ml) and patient serum-treated (1:10 dilution) cardiomyocytes decreased to 42 and -72% of the corresponding control groups. The extent of cell apoptosis increased in AL-09-treated cardiomyocytes compared with the control group. RNA-Seq showed 256 DEGs co-existed in the two paired groups, including 127 upregulated and 88 downregulated genes. The KEGG pathways for upregulated expressed genes included the 'TGF-β signaling pathway', the 'Hedgehog signaling pathway', the 'ErbB signaling pathway' and 'lysine degradation'. The higher mRNA expression of bone morphogenetic protein (, prostaglandin G/H synthase , epiregulin, and procollagen-lysine,2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 were confirmed. The KEGG pathways of downregulated expressed genes included genes involved with the 'p53 signaling pathway' and the 'cell cycle'. The mRNA expression levels of E3 ubiquitin-protein ligase CCNB1IP1 showed significant downregulation in the AL-09 peptide group compared with those in the 6xHis peptide group. In conclusion, cardiomyocytes treated with amyloidogenic λ and κ LCs presented with decreased cell viability compared with controls. Cell apoptosis increased in κ LC-treated cells compared with controls. The gene expression profiles associated with transforming growth factor-β-bone morphogenetic protein, the receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 signaling pathways, prostaglandins, collagen production, the p53 signaling pathway and the cell cycle were altered in light-chain-treated cardiomyocytes.

Copyright: © Xu et al.