組換えアデノウイルスAd-mir-22のHepG2細胞におけるグルコース取り込みへの影響

[Effect of recombinant adenovirus Ad-mir-22 on glucose uptake in HepG2 cells].

• Lihong Liao
• Wenbin Yuan
• Yong Chen
• Jichao Liang

抄録

miR-22を発現する組換えアデノウイルス（Ad-miR-22）を構築し、HepG2細胞におけるインスリンシグナル経路およびグルコース取り込みに対するAd-miR-22の影響を解析した。ヒト肝細胞からMiR-22遺伝子をPCRで増幅し、pAdTrack-CMVベクターにクローニングしてシャトルプラスミドpAdT-22を作製した。PCRおよびシークエンシングにより陽性コロニーを確認した。結果として得られたシャトルプラスミドは、組換えプラスミドpAd-miR-22を作成するために、アデノウイルスバックボーンプラスミド（pAdEasy-1）を含む有能なBJ5183細胞への共トランスフォームが続いて、Pme Iで線形化された。Pac Iで消化した後、線状化したpAd-miR-22を293Aパッケージング細胞株にトランスフェクトし、組換えアデノウイルスAd-miR-22を作製した。HepG2細胞にAd-miR-22または対照Ad-GFP（緑色蛍光タンパク質を発現するアデノウイルス）を感染させた後、qPCRによりmiR-22の発現量を解析した。その結果、アデノウイルスを介したmiR-22の過剰発現は、HepG2細胞におけるインスリン誘導性グルコース取り込みを有意に減少させた。さらに、miR-22の過剰発現は、インスリン誘導性のGSK-3βのリン酸化を著しく減少させた。さらに、ウエスタンブロットの結果、Ad-miR-22感染HepG2細胞では、Ad-GFP感染HepG2細胞と比較して、SIRT1のタンパク質発現が低下していることが明らかになった。以上のことから、miR-22 の過剰発現は、HepG2 細胞におけるグルコース取り込みを減少させる一方で、グルコース新生を有意に増加させた。このことから、miR-22のグルコース代謝への影響はSIRT1を介している可能性が示唆された。

The recombinant adenoviruses expressing miR-22 (Ad-miR-22) was constructed and the effect of Ad-miR-22 on insulin signal pathway and glucose uptake in HepG2 cells was analyzed. MiR-22 gene was amplified by PCR from human hepatocytes and cloned into the pAdTrack-CMV vector to generate the shuttle plasmid pAdT-22. The positive colonies were confirmed by PCR and sequencing. The resultant shuttle plasmid was linearized with Pme I, followed by co-transformation into competent BJ5183 cells containing an adenoviral backbone plasmid (pAdEasy-1) to create the recombinant plasmid pAd-miR-22. After digested with Pac I, the linearized pAd-miR-22 was transfected into 293A packaging cell line to generate recombinant adenoviruses Ad-miR-22. HepG2 cells were infected with Ad-miR-22 or control Ad-GFP (adenoviruses expressing green fluorescent protein), and then the miR-22 expression levels were analyzed by qPCR. The result shows that adenovirus-mediated overexpression of miR-22 significantly decreased insulin-induced glucose uptake in HepG2 cells. Moreover, overexpression of miR-22 markedly decreased insulin-induced phosphorylation of GSK-3β. miR-22 also increased the mRNA levels of gluconeogenic genes in HepG2 cells. Furthermore, Western blotting results indicate that the protein expression of SIRT1 decreased in Ad-miR-22 infected HepG2 cells as compared with Ad-GFP infected HepG2 cells. In summary, overexpressing of miR-22 significantly increased gluconeogenesis while decreased glucose uptake in HepG2 cells. The effect of miR-22 on glucose metabolism may be mediated by SIRT1.

文中构建了miR-22 重组腺病毒Ad-miR-22，文中构建了miR-22重组腺病毒Ad-miR-22分析了其对HepG2 细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。过PCR 方法，扩增了miR-22 的前体及侧翼序列，酶切后克隆至腺病毒穿梭载体体穿质-CMV 中，构建梭穿质粒pAdT-22，经PCR 及序测鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后，直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183，产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22，最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3 轮扩增后感染HepG2 细胞，通过荧光定量PCR 检测miR-22 表达水平。通过葡萄糖摄取材实验观察Ad-miR-22对HepG2 细胞葡萄糖摄取的影响。采用ウエスタンブロッティング 检测Ad-miR-22 对。HepG2 细胞SIRT1 在蛋白质水平的表达及GSK-3β 磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR 检miR-22 对PEPCK 及G6Pase 等基因在mRNA 水平表达的影响。 结果表明重症腺病毒Ad-miR-22 感染显著增加HepG2 细胞miR-22 表达水平。此外，Ad-miR-22 显示。著抑制胰岛素诱导的HepG2 葡萄糖摄取，并通过下调GSK-3β 摄取，并通过下调GSK-3β 磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22 反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用，并下调SIRT1 基因在蛋白质水平的表达。构建了miR-22的重组腺病毒，发现其显著增加糖异生，抑制HepG2 细胞葡萄糖摄取，该作用可能与miR-22 调节SIRT1 在蛋白质水平的表达有关。

文中构建了miR-22 重组腺病毒Ad-miR-22，分析了其对HepG2 细胞胰岛素信号通路及葡萄糖摄取的抑制作用。通过PCR 方法，扩增了miR-22 的前体及侧翼序列，酶切后克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV 中，构建穿梭质粒pAdT-22，经PCR 及测序鉴定。穿梭质粒经PmeⅠ线性化后，直接转化含有腺病毒骨架载体的感受态细胞BJ5183，产生重组腺病毒质粒Ad-miR-22，最后经PacⅠ线性化后转染包装细胞系293A。重组腺病毒经过3 轮扩增后感染HepG2 细胞，通过荧光定量PCR 检测miR-22 表达水平。通过葡萄糖摄取实验观察Ad-miR-22对HepG2 细胞葡萄糖摄取的影响。采用Western blotting 检测Ad-miR-22 对HepG2 细胞SIRT1 在蛋白质水平的表达及GSK-3β 磷酸化水平的影响。采用荧光定量PCR 检测miR-22 对PEPCK 及G6Pase 等基因在mRNA 水平表达的影响。结果表明，重组腺病毒Ad-miR-22 感染显著增加HepG2 细胞miR-22 表达水平。此外，Ad-miR-22 显著抑制胰岛素诱导的HepG2 葡萄糖摄取，并通过下调GSK-3β 磷酸化抑制胰岛素信号通路的激活。Ad-miR-22 反转胰岛素对糖异生关键酶表达的抑制作用，并下调SIRT1 基因在蛋白质水平的表达。综上所述，构建了miR-22的重组腺病毒，发现其显著增加糖异生，抑制HepG2 细胞葡萄糖摄取，该作用可能与miR-22 调节SIRT1 在蛋白质水平的表达有关。.