均一な粒子径とユニークな輸送タンパク質関連タンパク質コロナを持つFe/Mg修飾炭酸アパタイトは、乳がん細胞にドキソルビシンを効率的に送達する

Fe/Mg-Modified Carbonate Apatite with Uniform Particle Size and Unique Transport Protein-Related Protein Corona Efficiently Delivers Doxorubicin into Breast Cancer Cells.

• Sheikh Tanzina Haque
• Md Emranul Karim
• Syafiq Asnawi Zainal Abidin
• Iekhsan Othman
• Mark M Banaszak Holl
• Ezharul Hoque Chowdhury

抄録

乳がんとは、乳房内の細胞が制御不能に異常に増殖することです。化学療法などの従来の治療法では、健康な細胞に悪影響を及ぼすことが知られています。非ウイルス性無機ナノ粒子（NP）は、安定性、形状や大きさの制御、表面修飾の容易さ、独自の磁気的・光学的特性など、独自の特性を有しており、魅力的な薬剤担体となっています。その中でも炭酸アパタイト（CA）粒子はpH応答性に優れており、細胞内への薬物放出を迅速に行うことができますが、一般的には不均一で自己凝集しやすいという特徴があります。本研究では、CAの基本格子構造にCaをMgとFeで部分的に置換することでナノキャリアを改良し、自己凝集を緩和し、血清存在下で特異的なタンパク質コロナを形成し、抗がん剤であるドキソルビシン（DOX）を乳がん細胞内に効率的に送達する能力を持つFe/Mg-炭酸アパタイト（Fe/Mg-CA）NPを形成した。Fe/Mg-CA NPの2つの製剤は、重炭酸塩緩衝DMEM（ダルベッコの変性イーグルの培地）中のCaの固定量と一緒に鉄とMgの異なる濃度を添加することによって生成された、37℃で30分間のインキュベーションが続いた。粒子は、濁度分析、z平均直径およびゼータ電位測定、光学顕微鏡、電界放出走査電子顕微鏡（FESEM）、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）、エネルギー分散型X線（EDX）、火炎原子吸光分光法（FAAS）、pH溶解、薬物結合、細胞取り込み、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ、安定性分析、およびLCMS（液体クロマトグラフィー質量分析法）によるタンパク質コロナ研究によって特徴付けられた。その結果、Fe/Mg-CAの両製剤は、ほとんどが均一なナノサイズの粒子であり、凝集する傾向が少ないことがわかった。また，EDXおよびFAAS元素分析により，粒子中のCa，FeおよびMgの重量（％）およびCa/P比を確認した。DOXの初期濃度が5μMから10μMの場合、一定の薬物結合効率が得られた。Fe/Mg-CA NPのpH溶解試験では、酸性pHでDOXが速やかに放出されることが明らかになった。また，化学療法薬に対する細胞毒性の増強は，Fe/Mg-CA NPの方がCA NPに比べて大きかったが，これはFe/Mg-CA NPのz平均径が小さいために細胞内への内包が増加したためと説明できる。LCMS によるタンパク質コロナ研究では、Fe/Mg-CA NP は輸送タンパク質に対して最高の親和性を示したが、オプソニンとの結合は認められなかった。生物分配研究は、BALB/C 4T1腫瘍担持マウスにおけるDOXの組織分配に対するDOX負荷Fe/Mg-CA NPの効果を研究するために実施された。Fe/Mg-CA NPの両製剤は、腫瘍におけるDOXの蓄積を有意に増加させた。興味深いことに、高Fe/Mg-CA NPは低Fe/Mg-CA NPと比較して標的外分布が少ないことを示した。さらに，血漿分析の結果，DOXを負荷した低Fe/Mg-CA NPと高Fe/Mg-CA NPは，遊離DOX溶液に比べて血中循環半減期が延長していることが明らかになった．FeとMgでCA NPを修飾することで、凝集しにくいナノサイズの粒子が生成し、酸性pHでの薬物放出を阻害することなく、薬物結合効率、細胞内取り込み、細胞毒性を高めるとともに、DOXの循環半減期や腫瘍蓄積性を改善することができました。したがって、輸送タンパク質関連タンパク質のコロナを形成するFe/Mg-CAは、乳がん治療のための有用なキャリアとなる可能性があります。

Breast cancer is the abnormal, uncontrollable proliferation of cells in the breast. Conventional treatment modalities like chemotherapy induce deteriorating side effects on healthy cells. Non-viral inorganic nanoparticles (NPs) confer exclusive characteristics, such as, stability, controllable shape and size, facile surface modification, and unique magnetic and optical properties which make them attractive drug carriers. Among them, carbonate apatite (CA) particles are pH-responsive in nature, enabling rapid intracellular drug release, but are typically heterogeneous with the tendency to self-aggregate. Here, we modified the nano-carrier by partially substituting Ca with Mg and Fe into a basic lattice structure of CA, forming Fe/Mg-carbonate apatite (Fe/Mg-CA) NPs with the ability to mitigate self-aggregation, form unique protein corona in the presence of serum and efficiently deliver doxorubicin (DOX), an anti-cancer drug into breast cancer cells. Two formulations of Fe/Mg-CA NPs were generated by adding different concentrations of Fe and Mg along with a fixed amount of Ca in bicarbonate buffered DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), followed by 30 min incubation at 37 °C. Particles were characterized by turbidity analysis, z-average diameter and zeta potential measurement, optical microscopy, field emission scanning electron microscopy (FESEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), energy dispersive X-ray (EDX), flame atomic absorption spectroscopy (FAAS), pH dissolution, drug binding, cellular uptake, thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) assay, stability analysis, and protein corona study by LCMS (Liquid chromatography-mass spectrometry). Both formulations of Fe/Mg-CA displayed mostly uniform nano-sized particles with less tendency to aggregate. The EDX and FAAS elemental analysis confirmed the weight (%) of Ca, Fe and Mg, along with their Ca/P ratio in the particles. A constant drug binding efficiency was noticed with 5 μM to 10 μM of initial DOX concentration. A pH dissolution study of Fe/Mg-CA NPs revealed the quick release of DOX in acidic pH. Enhancement of cytotoxicity for the chemotherapy drug was greater for Fe/Mg-CA NPs as compared to CA NPs, which could be explained by an increase in cellular internalization as a result of the small z-average diameter of the former. The protein corona study by LCMS demonstrated that Fe/Mg-CA NPs exhibited the highest affinity towards transport proteins without binding with opsonins. Biodistribution study was performed to study the effect of DOX-loaded Fe/Mg-CA NPs on the tissue distribution of DOX in Balb/c 4T1 tumor-bearing mice. Both formulations of Fe/Mg-CA NPs have significantly increased the accumulation of DOX in tumors. Interestingly, high Fe/Mg-CA NPs exhibited less off-target distribution compared to low Fe/Mg-CA NPs. Furthermore, the blood plasma analysis revealed prolonged blood circulation half-life of DOX-loaded low and high Fe/Mg-CA NPs compared to free DOX solution. Modifying CA NPs with Fe and Mg, thereby, led to the generation of nano-sized particles with less tendency to aggregate, enhancing the drug binding efficiency, cellular uptake, and cytotoxicity without hampering drug release in acidic pH, while improving the circulation half-life and tumor accumulation of DOX. Therefore, Fe/Mg-CA which predominantly forms a transport protein-related protein corona could be a proficient carrier for therapeutic delivery in breast cancer.