ストレプトマイセスにおける効率的なCRISPR-Cas9媒介組換えのためのCas9発現レベルの微調整

Fine-tuning the regulation of Cas9 expression levels for efficient CRISPR-Cas9 mediated recombination in Streptomyces.

• Suhui Ye
• Behnam Enghiad
• Huimin Zhao
• Eriko Takano

抄録

CRISPR-Cas9は放線菌にとって非常に強力な遺伝子編集ツールであることが証明されており、バイオテクノロジーに関連する微生物の選択された系統において、傷のない正確なゲノム編集を可能にしている。しかし、放線菌におけるその一般的な応用は、未試験の株に適用した場合には、その有効性が低いために制限されてきた。ここでは、モデル放線菌であるStreptomyces coelicolor M145およびStreptomyces lividans TK24に対して、Cas9レベルがどのように毒性を示すかの証拠を提供する。我々は、Cas9レベルを低下させることによってこの毒性を克服し、Cas9発現がテオフィリン誘導性または構成的プロモーターによって制御されているプラスミドのセットを生成した。我々は、グリセロール取り込みオペロンとアクチノールホジン生合成遺伝子クラスターを用いて、これらのCRISPR-Cas9システムのターゲティングを検証した。この結果は、アクチノミセスにおける遺伝子編集を最適かつ効率的に行うためには、Cas9の発現レベルを株間で特異的に調整することが重要であることを示している。

CRISPR-Cas9 has proven as a very powerful gene editing tool for Actinomyces, allowing scarless and precise genome editing in selected strains of these biotechnologically relevant microorganisms. However, its general application in actinomycetes has been limited due to its inefficacy when applying the system in an untested strain. Here, we provide evidence of how Cas9 levels are toxic for the model actinomycetes Streptomyces coelicolor M145 and Streptomyces lividans TK24, which show delayed or absence of growth. We overcame this toxicity by lowering Cas9 levels and have generated a set of plasmids in which Cas9 expression is either controlled by theophylline-inducible or constitutive promoters. We validated the targeting of these CRISPR-Cas9 system using the glycerol uptake operon and the actinorhodin biosynthesis gene cluster. Our results highlight the importance of adjusting Cas9 expression levels specifically in strains to gain optimum and efficient gene editing in Actinomyces.