アンモニア処理鶏脾臓リンパ球におけるmiR-15aによるアポトーシスとミトコンドリア経路を介した酸化ストレスの発生にNF-κB経路が関与していることを明らかにしました

NF-κB pathway took part in the development of apoptosis mediated by miR-15a and oxidative stress via mitochondrial pathway in ammonia-treated chicken splenic lymphocytes.

• Dechun Chen
• Fangyong Ning
• Jingyang Zhang
• You Tang
• Xiaohua Teng

抄録

刺激臭のあるガスの一種であるアンモニアは、家畜や人に有害であり、大気にも悪影響を及ぼします。しかし、アンモニアによる脾臓毒性のメカニズムは未だによくわかっていない。本研究の目的は、鶏の脾臓リンパ球に対するアンモニアの影響をアポトーシスの観点から検討することであった。鶏脾臓リンパ球を対照群とアンモニア処理群（1mmol/Lおよび5mmol/Lアンモニア）に分け、24時間培養した。CCK-8、フローサイトメトリー（FC）、蛍光顕微鏡、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）、ウェスタンブロットを用いて、各群間の違いを調べた。その結果、アンモニア曝露はミトコンドリアからのカルシウム(Ca)と活性酸素種(ROS)の放出を増加させることがわかった。また、グルタチオンペルオキシダーゼ（GPx）、炎症関連遺伝子（核内因子-κB（NF-κB）、シクロオキシゲナーゼ-2（COX-2）、誘導性一酸化窒素（iNOS）、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）、形質転換成長因子-βのmRNAレベルの増加が認められた。(TGF-β)）、アポトーシス関連遺伝子（B細胞リンパ腫-2（BCL-2）、Bcl-2 associated X protein（BAX）、Cytochrome c（Cytc）、アポトーシスプロテアーゼ活性化因子1（APAF1）、Caspase-9、Caspase-3）、NF-κB、iNOS、BAX、Cytc、Caspase-9、Caspase-3の蛋白質レベルの上昇が認められた。同時に、アンモニアに曝露した脾臓リンパ球では、GPxタンパク質発現量の低下、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）mRNA発現量の低下、ヘムオキシゲナーゼ-1（HO-1）およびBCL-2 mRNAおよびタンパク質発現量の低下が認められた。一方、miR-15aの発現はアンモニア曝露下で増加した。以上の結果から、アンモニアは酸化ストレスを誘発し、ミトコンドリアからのCa、Cytc、活性酸素の放出を促進し、ミトコンドリアを介した炎症反応を誘発し、最終的にはアポトーシスの引き金となることが示唆された。

Ammonia, a kind of gas with pungent smell, is harmful to livestock and people, and has bad influence on the atmosphere. However, the mechanism of splenic toxicity caused by ammonia is still poorly understood. The aim of present study was to investigate the effect of ammonia on chicken splenic lymphocytes from the perspective of apoptosis. Chicken splenic lymphocytes were divided into the control group and the two ammonium treatment groups (1 mmol/L and 5 mmol/L ammonia), and were cultured for 24 h. CCK-8, flow cytometry (FC), fluorescence microscope, quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and Western blot were used to study the differences between different groups. The results showed that ammonia exposure increased the release of calcium (Ca) and reactive oxygen species (ROS) from mitochondrion. Besides, we found an increase in mRNA levels of glutathione peroxidase (GPx), inflammation-related genes (nuclear factor-κB (NF-κB), cyclooxygenase-2 (COX-2), inducible nitric (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and transforming growth factor-β (TGF-β)), apoptosis-related genes (B-cell lymphoma-2 (BCL-2), Bcl-2 associated X protein (BAX), Cytochrome c (Cytc), apoptotic protease activating factor 1 (APAF1), Caspase-9, and Caspase-3), and an increase in protein levels of NF-κB, iNOS, BAX, Cytc, Caspase-9, and Caspase-3. At the same time, we found a decrease level of GPx protein expression, and a decrease level of glutathione S-transferase (GST) mRNA expression, and a decrease level of heme oxygenase-1 (HO-1) and BCL-2 mRNA and protein expression in splenic lymphocytes exposed to ammonia. Meanwhile, miR-15a expression increased under ammonia exposure. In summary, these results indicated that ammonia induced oxidative stress, promoted the release of Ca, Cytc, and ROS from mitochondria, and then induced mitochondria-mediated inflammatory response, finally triggered apoptosis in chicken splenic lymphocytes.

Copyright © 2020. Published by Elsevier B.V.