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長時間スカーインアジャー：細胞外マトリックス合成のバイオマーカーを用いた抗線維化療法のin vitroスクリーニングツール
Prolonged Scar-in-a-Jar: an in vitro screening tool for anti-fibrotic therapies using biomarkers of extracellular matrix synthesis.
PMID: 32381012 PMCID: PMC7203825. DOI: 10.1186/s12931-020-01369-1.
抄録
背景:
特発性肺線維症（IPF）は急速に進行し、管理が困難な疾患である。新規の有効な治療法を見つけるためには、抗線維化化合物のスクリーニングのためのより良い前臨床モデルが必要とされています。活性化された線維芽細胞は線維形成を促進し、細胞外マトリックス（ECM）の蓄積を担う主要な細胞である。ここでは、ECM合成の臨床的に検証された生化学的マーカーを用いてECM合成の経時変化を評価するために、長時間のスカー・イン・ア・ジャーアッセイを併用した。このモデルを新規抗線維症性化合物の薬物スクリーニングツールとして検証するために、IPFで承認されている2つの抗線維症性化合物、ニンテダニブとピルフェニドン、および開発中の化合物であるオミパリシブを試験しました。
BACKGROUND: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a rapidly progressing disease with challenging management. To find novel effective therapies, better preclinical models are needed for the screening of anti-fibrotic compounds. Activated fibroblasts drive fibrogenesis and are the main cells responsible for the accumulation of extracellular matrix (ECM). Here, a prolonged Scar-in-a-Jar assay was combined with clinically validated biochemical markers of ECM synthesis to evaluate ECM synthesis over time. To validate the model as a drug screening tool for novel anti-fibrotic compounds, two approved compounds for IPF, nintedanib and pirfenidone, and a compound in development, omipalisib, were tested.
方法:
健康なドナーからの初代ヒト肺線維芽細胞をフィコールの存在下で12日間培養し、ALK5/TGF-β1受容体キナーゼ阻害剤（ALK5i）、ニンテダニブ、ピルフェニドン、またはmTOR/PI3K阻害剤オミパリシブ（GSK2126458）の投与の有無にかかわらず、TGF-β1で刺激した。ECM合成のバイオマーカーは、タイプI、III、IV、VおよびVIのコラーゲン形成（PRO-C1、PRO-C3、PRO-C4、PRO-C5、PRO-C6）、フィブロネクチン（FBN-C）沈着およびα平滑筋アクチン（α-SMA）発現を評価するためにELISAsを用いて細胞上清中で経時的に評価された。
METHODS: Primary human lung fibroblasts from healthy donors were cultured for 12 days in the presence of ficoll and were stimulated with TGF-β1 with or without treatment with an ALK5/TGF-β1 receptor kinase inhibitor (ALK5i), nintedanib, pirfenidone or the mTOR/PI3K inhibitor omipalisib (GSK2126458). Biomarkers of ECM synthesis were evaluated over time in cell supernatants using ELISAs to assess type I, III, IV, V and VI collagen formation (PRO-C1, PRO-C3, PRO-C4, PRO-C5, PRO-C6), fibronectin (FBN-C) deposition and α-smooth muscle actin (α-SMA) expression.
結果:
TGF-β1はすべての時点で刺激を受けていない線維芽細胞と比較してPRO-C1、PRO-C6、FBN-Cの合成を誘導したが、PRO-C3とα-SMAレベルは8日目まで上昇しなかった。バイオマーカーの上昇は、ALK5iによるTGF-β1シグナル伝達の抑制により減少した。ニンテダニブとオミパリシブはTGF-β1によって誘導されるすべてのバイオマーカーを濃度依存的に減少させることができたが、ピルフェニドンはα-SMAには効果がなかった。
RESULTS: TGF-β1 induced synthesis of PRO-C1, PRO-C6 and FBN-C as compared with unstimulated fibroblasts at all timepoints, while PRO-C3 and α-SMA levels were not elevated until day 8. Elevated biomarkers were reduced by suppressing TGF-β1 signalling with ALK5i. Nintedanib and omipalisib were able to reduce all biomarkers induced by TGF-β1 in a concentration dependent manner, while pirfenidone had no effect on α-SMA.
結論:
TGF-β1はI型、III型、VI型コラーゲン、フィブロネクチン、α-SMAの合成を刺激したが、IV型、V型コラーゲンの合成は刺激しなかった。合成は時間的プロファイルは異なるものの、時間経過とともに増加し、ALK5i、ニンテダニブ、ピルフェニドン、およびオミパリシブによって薬理学的に調節された。ECM合成の生化学的マーカーを利用したこの12日間の長時間スカーインアジャーアッセイは、新規抗線維化化合物のスクリーニングに有用なツールとなる。
CONCLUSIONS: TGF-β1 stimulated synthesis of type I, III and VI collagen, fibronectin and α-SMA but not type IV or V collagen. Synthesis was increased over time, although temporal profiles differed, and was modulated pharmacologically by ALK5i, nintedanib, pirfenidone and omipalisib. This prolonged 12-day Scar-in-a-Jar assay utilising biochemical markers of ECM synthesis provides a useful screening tool for novel anti-fibrotic compounds.