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大規模ホスホプロテオーム研究におけるトリプシンとリサルジナーゼのミラースペクトルの組み合わせによるホスホサイト局在の明確化
Unambiguous Phosphosite Localization through the Combination of Trypsin and LysargiNase Mirror Spectra in a Large-Scale Phosphoproteome Study.
PMID: 32388983 DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00562.
抄録
キナーゼが誘導するシグナル伝達経路を理解するためには、ホスホサイトの同定と解析が必要です。質量分析法（MS）を用いたホスホプロテオーム研究は、迅速かつ高感度なアプローチでホスホサイトをハイスループットで同定することができます。しかし、単一のプロテアーゼを用いた MS データからのホスホサイトの同定は、ホスホペプチドの検出に使用される戦略にかかわらず、曖昧なものになる可能性が高い。ここで、我々 は最近トリプシンと同様に N 末端側のみでアルギニンとリジン残基を切断する特異性が報告されている LysargiNase の適用を検討しました。その結果、トリプシンとLysargiNaseのミラースペクトルを組み合わせることで、MSスペクトルのイオンカバレッジが高くなることがわかった。トリプシンスペクトル、LysargiNaseスペクトル、複合スペクトルにおけるbイオンのイオンカバレッジ中央値は、それぞれ8.3、20.5、25.0%であった。yイオンのイオンカバレッジ中央値は27.8、10.0、32.3%であった。イオンカバレッジが高いほど、正確なリン酸化物をピンポイントで検出することが可能であることがわかった。トリプシン単独の場合と比較して、トリプシンとLysargiNaseのミラースペクトルを併用することで、信頼性の低いスコア（信頼度スコア＜0.75）だったミラースペクトルの67.1％が信頼性の高いスコア（信頼度スコア≧0.75）となった。一方、トリプシンおよびリサルジナーゼ消化物からの複数の潜在的なホスホサイトを有するミラーペプチドスペクトルマッチ(PSM)のすべては、組み合わせ戦略を適用した後、1つの正確なホスホサイトを割り当てることができた。また、結合法は結合法に比べてより多くの新規ホスホサイトを同定することができた。その結果、3つの新規ホスホサイトに対応する3つのホスホペプチドを合成し、その同定の信頼性を検証した。これらのデータを総合すると、本研究で紹介した組み合わせ戦略が、ホスホサイトの明確な局在化に有効であることが明らかになった（プロジェクトアクセッション PXD011178）。
Understanding of the kinase-guided signaling pathways requires the identification and analysis of phosphosites. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics is a rapid and highly sensitive approach for high-throughput identification of phosphosites. However, phosphosite determination from MS data with a single protease is more likely to be ambiguous, regardless of the strategy used for phosphopeptide detection. Here, we explored the application of LysargiNase, which was recently reported to mirror trypsin in specificity to cleave arginine and lysine residues exclusively at the N-terminal side. We found that the combination of trypsin and LysargiNase mirror spectra resulted in higher ion coverage in MS spectra. The median ion coverage values of b ions in tryptic spectra, LysargiNase spectra, and combined spectra are 8.3, 20.5, and 25.0%, respectively. As for the median ion coverage of y ions, these values are 27.8, 10.0, and 32.3%. Higher ion coverage was helpful to pinpoint the precise phosphosites. Compared to trypsin alone, the combined use of trypsin and LysargiNase mirror spectra enabled 67.1% of mirror spectra with unreliable scores (confidence score <0.75) to become reliable (confidence score ≥ 0.75). Meanwhile, all of the mirror peptide-spectrum matches (PSMs) with multiple potential phosphosites from trypsin and LysargiNase digests could be assigned one precise phosphosite after applying the combination strategy. Besides, the combination strategy could identify more novel phosphosites than the union strategy did. We synthesized three phosphopeptides corresponding to the three novel phosphosites and validated the reliability of the identification. Taken together, our data demonstrated the distinctive potential of the combination strategy presented here for unambiguous phosphosite localization (Project accession PXD011178).