枯草菌におけるN-アセチルノイラミン酸バイオセンサーの開発と最適化

Development and optimization of N-acetylneuraminic acid biosensors in Bacillus subtilis.

• Xiaolong Zhang
• Yanting Cao
• Yanfeng Liu
• Long Liu
• Jianghua Li
• Guocheng Du
• Jian Chen

抄録

転写因子（TF）をベースとした代謝物応答性バイオセンサーは、所望の特性を持つ人工酵素をスクリーニングしたり、生合成経路を動的に制御したりするための重要なツールである。しかし、TFベースのバイオセンサーの構築は、TF結合部位の配列挿入による遺伝子発現への望ましくない影響や、予測できない最適なTF発現レベルによって制約を受けることが多い。本研究では、枯草菌のN-アセチルニューラミン酸(NeuAc)バイオセンサーをケーススタディとして、段階的なTFベースバイオセンサー構築アプローチを開発した。具体的には、第１のプロモーターライブラリーとして、様々な強度を持つ12個のプロモーターを選択した。次に、選択したプロモーターの様々な位置にNanRの結合部位配列を挿入して第２のプロモーターライブラリーを作製した結果、プロモーターの強度に大きな影響を与えることなく、TF結合部位配列（NanO）を含む６つの遺伝子組換えプロモーターが得られた。発現レベルの異なるNanR発現カセットをさらに統合してバイオセンサーライブラリーを構築し、NeuAc非存在下で効率的に抑制された9つのNeuAcバイオセンサーを得た。最後に、バイオセンサーの活性化については、緑色蛍光タンパク質レポーターの発現量の倍数変化をin vivoで測定したところ、NeuAc存在下で61倍の活性化が確認された。本研究で開発した NeuAc バイオセンサーは、枯草菌の NeuAc 生合成を促進するための遺伝子組換え酵素のスクリーニングに利用することができます。

Transcriptional factor (TF)-based metabolite-responsive biosensors are important tools for screening engineered enzymes with desired properties and for the dynamic regulation of biosynthetic pathways. However, TF-based biosensor construction is often constrained by undesired effects of TF-binding site sequence insertion on gene expression and unpredictable optimal TF expression levels. In the present study, a stepwise TF-based biosensor construction approach was developed using an N-acetylneuraminic acid (NeuAc) biosensor for Bacillus subtilis, as a case study. Specifically, 12 promoters with various strengths were selected as the first promoter library. Next, binding site sequences for the NanR were inserted into various positions of the selected promoter sequences to develop the second promoter library, resulting in 6 engineered promoters containing TF-binding site sequences (NanO), without major effects on promoter strength. NanR expression cassettes with different expression levels were further integrated to construct the biosensor library, yielding 9 NeuAc biosensors with efficient repression in the absence of NeuAc. Finally, biosensor activation was characterized by testing fold changes in expression levels of the green fluorescent protein reporter in the presence of NeuAc in vivo, which revealed 61-fold activation when NeuAc was present. The NeuAc biosensor developed in this study can be used for screening engineered enzymes for enhanced NeuAc biosynthesis in B. subtilis.

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