非天然アミノ酸系を用いた遺伝子マーカーリストの拡張。遺伝資源の効率的なゲノム改変戦略

Extension of Genetic Marker List Using Unnatural Amino Acid System: An Efficient Genomic Modification Strategy in .

• Xinyi Xu
• Huichang Zhong
• Weifeng Liu
• Yong Tao

抄録

染色体工学を含む遺伝子操作は、細胞の代謝を再構築するために不可欠な技術である。ラムダ/レッド（λ/レッド）を媒介とした組換えは、細胞の代謝を制御するための最も一般的な方法である。 しかし、この方法の効率は、選択可能なマーカーの除去に手間がかかることによって著しく阻害されている。この問題を克服するために、Redリコンビナーゼ、Creリコンビナーゼ、外因性直交アミノアシル転移RNA（tRNA）合成酵素/tRNA対を含む統合ヘルパープラスミドpSBC1a-CtRを構築し、抗生物質耐性遺伝子コードタンパク質の定義された部位に不自然なアミノ酸（UAA）を遺伝的にコードすることを可能にした。ＵＡＡＡが培地中に存在しない場合、抗生物質耐性遺伝子コードタンパク質には発現が見られなかった。したがって、抗生物質耐性遺伝子を切除する次の手順は不要である。この方法を検証するために、Ｂ遺伝子のノックアウトに成功した。さらに、3 つの標的遺伝子（R, G, G, ）を逐次欠失させることで、高い成長率を示すニューロスポレン産生株を生成することができた。このように、部位特異的組み込み型UAA突然変異誘発システムを用いて、条件付き選択可能なマーカーの制御と利用の拡大を図ることができ、本技術を用いれば、神経スポレン産生株の迅速な連続ゲノム編集が可能となる。

Genetic manipulations including chromosome engineering are essential techniques used to restructure cell metabolism. Lambda/Red (λ/Red)-mediated recombination is the most commonly applied approach for chromosomal modulation in . However, the efficiency of this method is significantly hampered by the laborious removal of the selectable markers. To overcome the problem, the integration helper plasmid was constructed, pSBC1a-CtR, which contains Red recombinase, Cre recombinase, and exogenous orthogonal aminoacyl-transfer RNA (tRNA) synthetase/tRNA pairs, allows an unnatural amino acid (UAA) to be genetically encoded at the defined site of the antibiotic resistance gene-encoded protein. When UAAs are not in the culture medium, there was no expression in the antibiotic resistance gene-encoded protein. Accordingly, the next procedure of antibiotic gene excising is not needed. To verify this method, B gene was knocked out successfully. Furthermore, sequential deletion of three target genes (R, G, and ) was able to generate neurosporene-producing strain marked by high growth rate. Thus, the site-specific incorporation UAA mutagenesis system were used to control and expand the use of conditional selectable marker, and the technique is used to facilitate a rapid continuous genome editing in .

Copyright © 2020 Xu, Zhong, Liu and Tao.