dsRNAのナノマテリアル媒介送達を介したSf9細胞におけるRNAi。ポリ-l-アルギニンポリプレックスとポリ-l-アルギニン機能化金ナノ粒子の比較

RNAi in Sf9 Cells via Nanomaterial Mediated Delivery of dsRNA: A Comparison of Poly-l-arginine Polyplexes and Poly-l-arginine-Functionalized Au Nanoparticles.

• Jérôme Laisney
• Dhandapani Gurusamy
• Zeinah Elhaj Baddar
• Subba Reddy Palli
• Jason M Unrine

抄録

本研究では、ポリ-l-アルギニンとの複合体（PLR-ポリプレックス）、またはポリ-l-アルギニン機能化20nmのAuナノ粒子（PLR/Au NP）に担持されたdsRNAの送達に焦点を当てています。Sf9安定細胞株()で発現している遺伝子のRNA干渉(RNAi)をモデル系として用いた。すなわち、レイヤーバイレイヤー法によるクエン酸塩安定化Auナノ粒子（e-PLR/Auナノ粒子）上でのPLRの静電結合、または過剰な基をヒドロキシルアミン（c-PLR/Au/Hydナノ粒子）またはウシ血清アルブミン（c-PLR/Au/BSAナノ粒子）でクエン酸塩安定化Auナノ粒子（c-PLR/Auナノ粒子）表面上のNHS基とポリマーの共役結合反応である。透過型電子顕微鏡(TEM)、走査型透過型電子顕微鏡(STEM)、エネルギー分散型X線分光法(EDS)による元素マッピングにより、PLRとdsRNAの複合体に起因するPLR-ポリプレックス粒子の形成を明らかにした。遺伝子ノックダウン（ＧＫ）は、ミクロ化された（サイズ＞１μｍ）ＰＬＲポリプレックス（２０％ＧＫ）または共有結合性ＰＬＲ／Ａｕ／Ｈｙｄ（７％ＧＫ）粒子とは対照的に、Ｓｆ９細胞をナノスケール（サイズ＜１００ｎｍ）のＰＬＲポリプレックス（５８％ＧＫ）に曝露することにより、より効率的であることが判明した。ヒドロキシルアミンをリガンドとしてウシ血清アルブミンで置換することにより、GKの効率が大幅に向上した（31％GK）。CypHer5E標識dsRNAを用いて、dsRNA送達の重要な生理的障壁であるエンドソーム脱出を調べたところ、異なるナノシステムにコンジュゲートされたdsRNAは、コンジュゲートされていないものと比較して、細胞内に侵入する能力が高いことが示されました。本研究は、ナノ粒子サイズ、細胞培養培地中での安定性、高分子分子量とナノ粒子への結合強度、表面上のリガンドの性質など、鱗翅目細胞へのdsRNA送達に必要な材料の特性に関する貴重な情報を提供するものである。

This work focused on the delivery of dsRNA either complexed with poly-l-arginine (PLR-polyplex) or loaded onto poly-l-arginine functionalized 20 nm Au nanoparticles (PLR/Au NPs). RNA interference (RNAi) of a gene expressed in Sf9 stable cell line () was used as a model system. The binding affinity of dsRNA with two modes of functionalization of Au NPs was investigated: the electrostatic binding of PLR on citrate stabilized Au NPs (e-PLR/Au NPs) via the layer-by-layer method or the covalent-linking reaction of the polymer with NHS groups on the Au NPs surface (c-PLR/Au NPs) with excess groups quenched with either hydroxylamine (c-PLR/Au/Hyd NPs) or bovine serum albumin (c-PLR/Au/BSA NPs). The formation of PLR-polyplex particles resulting from the complexation of PLR and dsRNA were revealed by transmission electron microscope (TEM), scanning transmission electron microscope (STEM), and elemental mapping by energy dispersive X-ray spectroscopy (EDS). gene knockdown was evaluated after exposure of Sf9 cells for 72 h to 600 ng of dsRNA. Gene knockdown (GK) was found to be more efficient by exposing Sf9 cells to nanoscaled (size <100 nm) PLR-polyplex (58% GK), in contrast to microscaled (size >1 μm) PLR-polyplex (20% GK) or covalent PLR/Au/Hyd (7% GK) particles. The replacement of hydroxylamine by bovine serum albumin as ligand has significantly enhanced the efficiency of GK (31% GK). Investigation of endosomal escape, a key physiological barrier for dsRNA delivery, with CypHer5E labeled dsRNA showed the good ability for the dsRNA conjugated to the different nanosystems to enter the cells compared to the unconjugated one. This study provides valuable information concerning the required properties of materials used for dsRNA delivery in lepidopteran cells such as nanoparticle size, stability in the cell culture media, the polymer molecular weight and binding strength to the nanoparticle, and the nature of ligands on the surface.