ForenSeq™ DNA Signature Prep Kitとレーザーで微小解剖した細胞との互換性。細胞数の少ないサンプルで発生する問題点を探る

Compatibility of the ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit with laser microdissected cells: An exploration of issues that arise with samples containing low cell numbers.

• Ryan England
• Gemma Nancollis
• Janet Stacey
• Andrew Sarman
• Jason Min
• SallyAnn Harbison

抄録

大量並列シーケンシングは、法医学的なDNA分析における貴重なツールとして急速に台頭してきています。この技術の検証の一環として、ワンチューブDNA抽出プロセスを含むレーザーマイクロダイセクション細胞採取法との互換性を確立しました。また、レーザーマイクロダイセクションを使用して、有益なDNA配列プロファイルを生成するために必要な細胞数を調査し、この技術の限界を明らかにしました。ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit (Primer Mix B) と MiSeq FGx™ シーケンサーを使用して、レーザーマイクロダイセクションによる 1 本のチューブ抽出法と MPS の互換性を実証しましたが、増幅効率に対するジチオスレイトールの影響を打ち消すために塩化マグネシウムを添加するなど、メーカー推奨のライブラリー調製プロトコルに若干の変更を加えました。この作業により、少量のDNAサンプルからシーケンシングライブラリーを調製する際に遭遇する可能性のあるいくつかの品質上の問題が浮き彫りになりました。特に、少ない細胞数から調製されたライブラリーは、より多くの細胞から調製されたライブラリーと比較してアダプターダイマーのレベルが高いことがわかりました。この問題を解決するために、我々はビーズによる正規化ステップをqPCRによる正規化方法に置き換えました。ここでは、従来のキャピラリー電気泳動法で得られた結果と直接比較することができる常染色体およびY STRマーカーの結果に焦点を当てています。常染色体 STR DNA 配列の完全なプロファイル（27 遺伝子座）は、50 個の上皮細胞と 100 個の精子（精子細胞）から得ることができた。ForenSeq™ システムの検出限界は、常染色体と Y STR の両方について、25 個の上皮細胞と 25 個の精子細胞であると決定されました。細胞は、単一ソースのサンプルと精液と唾液の混合物の両方から解剖された。単一源サンプルから調製したライブラリーと混合源サンプルから調製したライブラリーとの間には、感度、汚染の有無、またはPCRアーティファクトに明らかな違いはなかった。

Massively parallel sequencing is rapidly emerging as a valuable tool in forensic DNA analyses. As part of our validation of this technology, we established its compatibility with a laser microdissection cell collection method including a one-tube DNA extraction process. We also used the laser microdissector to explore the number of cells required to generate informative DNA sequence profiles and establish the limitations of the technology. Using the ForenSeq™ DNA Signature Prep Kit (Primer Mix B) and a MiSeq FGx™ sequencer, we successfully demonstrated the compatibility of MPS with a laser microdissection one-tube extraction method, with minor alterations made to the manufacturer's recommended library preparation protocol, including the addition of magnesium chloride to counteract the effect of dithiothreitol on amplification efficacy. This work highlighted several quality issues that may be encountered when preparing sequencing libraries from low quantity DNA samples, particularly that libraries prepared from low cell numbers showed high levels of adapter dimer compared to those prepared from more cells. To remediate this, we replaced the bead normalisation step with a qPCR normalisation method, whereby sequencing libraries are diluted based on their molarity as determined after library purification. The work presented here focuses on the results from the autosomal and Y STR markers as these could be directly compared to results obtained from traditional capillary electrophoresis techniques. Full autosomal STR DNA sequence profiles (27 loci) could be obtained from 50 epithelial cells and 100 spermatozoa (sperm cells). The limit of detection for the ForenSeq™ system was determined to be 25 epithelial and 25 sperm cells for both autosomal and Y STRs. Cells were dissected from both single source samples and mixtures of semen and saliva. There was no apparent difference in sensitivity, presence of contamination or PCR artefacts between libraries prepared from single source samples and libraries prepared from mixed source samples.

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