C. crescentus xynA2 遺伝子のクローニング、発現および特性評価、および植物バイオマスの分解におけるキシラナーゼIIの応用

Cloning, expression and characterization of C. crescentus xynA2 gene and application of Xylanase II in the deconstruction of plant biomass.

• Débora Jacomini
• Larissa Bussler
• Juliana Moço Corrêa
• Marina Kimiko Kadowaki
• Alexandre Maller
• José Luis da-Conceição Silva
• Rita de Cássia Garcia Simão

抄録

バイオテクノロジーは、主にヘミセルロースを生分解して発酵性糖を放出する酵素を使用するため、産業用バイオプロセスに革新的な代替手段を提供しています。Caulobacter crescentus (C. crescentus)は、グリコヒドロラーゼ-GH10グループのキシラナーゼII (EC 3.2.1.8)をコードするxynA2 (CCNA_03137)のように、キシラン分解を担当する7つの遺伝子、5つのβ-キシロシダーゼ (EC 3.2.1.37)と2つのエンドオキシラナーゼ、を持っています。xynA2遺伝子をPCRにより増幅し、pTrcHisAベクターにクローニングし、大腸菌で効率的にHisタグ融合タンパク質を提供して過剰発現させた。組換えキシラナーゼ（XynA2）をニッケルセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製し、SDS-PAGEゲル上で43kDaの単一バンドを示した。XynA2は最適なアルカリ性pH(8)を示し、アルカリ性pHで24時間安定であった。C. crescentusはメソフィリックであるが、XynA2は60℃の最適温度を持ち、65℃の耐熱性を有していた。XynAはブナ材由来のキシランに対してセルラーゼを含まないキシラノール活性を示し、50μmolmLのキシロースの存在下では阻害されなかった。また、ジチオスレイトール(DTT)は、Kを低下させ(5.78μmolmL)、K/K比を増加させ(1.63 U s)、XynA2活性を誘導した。最後に、C. crescentus XynA2はトウモロコシのワラを効率的に加水分解し、産業界の様々な分野に応用できる還元糖の放出量が高いことを示した。

Biotechnology offers innovative alternatives for industrial bioprocesses mainly because it uses enzymes that biodegrade the hemicellulose releasing fermentable sugars. Caulobacter crescentus (C. crescentus) has seven genes responsible for xylanolytic cleavage, 5 to β-xylosidases (EC 3.2.1.37) and 2 for endoxylanases, like xynA2 (CCNA_03137) that encodes Xylanase II (EC 3.2.1.8) of the glycohydrolases-GH10 group. The xynA2 gene was amplified by PCR, cloned into the pTrcHisA vector e efficiently overexpressed in E. coli providing a His-tag fusion protein. Recombinant xylanase (XynA2) was purified by affinity chromatography using a nickel sepharose column and exhibited a single 43 kDa band on SDS-PAGE gel. XynA2 showed an optimum alkaline pH (8) and stability at alkaline pH for 24 h. Although C. crescentus is mesophilic, XynA2 has optimum temperature of 60 °C and is thermo-resistance at 65 °C. XynA maintains 66% of the enzymatic activity at high temperatures (90 °C) without being denatured.The enzyme displayed a xylanolitic activity free of cellulase to xylan from beechwood and it was not inhibited in the presence of 50 μmol mL of xylose. In addition, dithiothreitol (DTT) induced XynA2 activity, as it improved its kinetic parameters by lowering the K (5.78 μmol mL) and increasing the K/K ratio (1.63 U s). Finally, C. crescentus XynA2 efficiently hydrolyzed corn straw with high release of reducing sugars that can be applied in different branches of the industry.