リボソームとリシン毒素Aサブユニットの相互作用を標的とした低分子阻害剤

Small Molecule Inhibitors Targeting the Interaction of Ricin Toxin A Subunit with Ribosomes.

• Xiao-Ping Li
• Rajesh K Harijan
• Jennifer N Kahn
• Vern L Schramm
• Nilgun E Tumer

抄録

リシン毒素Aサブユニット（RTA）は、真核生物のリボソーム上の普遍的に保存されているサルシン/リシンループ（SRL）からアデニンを除去し、それによってタンパク質合成を阻害する。リシンの毒性に対して、高親和性で選択的な低分子治療用解毒剤は報告されていません。RTAはリボソームのP茎に結合し、SRLにアクセスする。この相互作用は、活性部位とは反対側の面にある、よく定義された疎水性ポケットで、RTAをPタンパク質のC末端に固定します。RTAリボソーム結合部位は、これまで低分子阻害剤によって標的化されていなかった。我々は、表面プラズモン共鳴を用いたフラグメントスクリーニングを用いて、RTAを結合する低分子量の鉛化合物を同定し、その相互作用を結晶学的に定義した。その結果、RTAに中マイクロモルの親和性で結合する5つのフラグメントを同定した。3つの化学的に異なる結合断片をRTAと共結晶化し、結晶構造を解いた。2つの断片はPストーク結合部位に結合し、3つ目の断片はPストーク結合部位とは異なるモチーフであるヘリックスDに結合していた。すべての断片は触媒部位から離れた場所でRTAと結合し、触媒部位の形状にほとんど変化を与えなかった。2つの断片は疎水性ポケットに特異的に結合し、低マイクロモル範囲の真核生物リボソーム上での触媒活性を阻害するのに十分な親和性を有していた。これらの阻害剤の結合様式は、P ストークペプチドの相互作用を模倣しており、低分子の阻害剤がリボソームへの RTA 結合を阻害し、治療的介入の可能性があることを立証した。

Ricin toxin A subunit (RTA) removes an adenine from the universally conserved sarcin/ricin loop (SRL) on eukaryotic ribosomes, thereby inhibiting protein synthesis. No high affinity and selective small molecule therapeutic antidotes have been reported against ricin toxicity. RTA binds to the ribosomal P stalk to access the SRL. The interaction anchors RTA to the P protein C-termini at a well-defined hydrophobic pocket, which is on the opposite face relative to the active site. The RTA ribosome binding site has not been previously targeted by small molecule inhibitors. We used fragment screening with surface plasmon resonance to identify small molecular weight lead compounds that bind RTA and defined their interactions by crystallography. We identified five fragments, which bound RTA with mid-micromolar affinity. Three chemically distinct binding fragments were cocrystallized with RTA, and crystal structures were solved. Two fragments bound at the P stalk binding site, and the third bound to helix D, a motif distinct from the P stalk binding site. All fragments bound RTA remote from the catalytic site and caused little change in catalytic site geometry. Two fragments uniquely bound at the hydrophobic pocket with affinity sufficient to inhibit the catalytic activity on eukaryotic ribosomes in the low micromolar range. The binding mode of these inhibitors mimicked the interaction of the P stalk peptide, establishing that small molecule inhibitors can inhibit RTA binding to the ribosome with the potential for therapeutic intervention.