ウイルスRNase III阻害剤のためのFRETベースのハイスループットスクリーニング法の開発

Development of FRET-based high-throughput screening for viral RNase III inhibitors.

• Linping Wang
• Jani Saarela
• Sylvain Poque
• Jari P T Valkonen

抄録

サツマイモ・クロロティック・スタントウイルス（CSR3）がコードするクラス1リボヌクレアーゼIII（RNase III）は、植物細胞内のRNAサイレンシングを抑制し、それにより、植物RNA干渉（RNAi）経路に不可欠な構成要素である宿主小干渉RNAを切断することで、宿主の抗ウイルス応答に対抗する。サツマイモクロロティックスタントウイルスとサツマイモフェザーリーモットルウイルスとの相乗効果により、作物の収量を90％減少させることができる。CSR3の阻害剤は、このウイルスの脅威に対抗するために有効であることが証明されるかもしれないが、そのような阻害剤を特定するためのスクリーンはまだ実施されていない。ここでは、CSR3 の阻害剤を同定するために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に基づく新しいハイスループットスクリーニング（HTS）アッセイを報告する。HTSによるCSR3活性のモニタリングには、FRET適合色素で標識された小型干渉RNA基質を使用した。最適化されたHTSアッセイにより、さまざまな低分子ライブラリから試験した6,620化合物のうち、109化合物のCSR3の潜在的な阻害剤が得られた。3つの最高の阻害剤候補は、用量反応アッセイで検証された。さらに、選択された候補化合物を大腸菌由来の類似したクラス1のRNase III酵素（EcR3）についても並行してスクリーニングを行ったところ、異なる一連の阻害剤が得られた。このように、我々の結果は、CSR3 と EcR3 酵素が異なるタイプの分子によって阻害されることを示しており、この HTS アッセイはクラス 1 RNase III 酵素の創薬に広く応用できることを示している。

The class 1 ribonuclease III (RNase III) encoded by Sweet potato chlorotic stunt virus (CSR3) suppresses RNA silencing in plant cells and thereby counters the host antiviral response by cleaving host small interfering RNAs, which are indispensable components of the plant RNA interference (RNAi) pathway. The synergy between sweet potato chlorotic stunt virus and sweet potato feathery mottle virus can reduce crop yields by 90%. Inhibitors of CSR3 might prove efficacious to counter this viral threat, yet no screen has been carried out to identify such inhibitors. Here, we report a novel high-throughput screening (HTS) assay based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) for identifying inhibitors of CSR3. For monitoring CSR3 activity via HTS, we used a small interfering RNA substrate that was labelled with a FRET-compatible dye. The optimized HTS assay yielded 109 potential inhibitors of CSR3 out of 6,620 compounds tested from different small-molecule libraries. The three best inhibitor candidates were validated with a dose-response assay. In addition, a parallel screen of the selected candidates was carried out for a similar class 1 RNase III enzyme from Escherichia coli (EcR3), and this screen yielded a different set of inhibitors. Thus, our results show that the CSR3 and EcR3 enzymes were inhibited by distinct types of molecules, indicating that this HTS assay could be widely applied in drug discovery of class 1 RNase III enzymes.

© 2020 The Authors. Molecular Plant Pathology published by British Society for Plant Pathology and John Wiley & Sons Ltd.