酵素活性化フルオロゲンプローブを用いたナチュラルキラー細胞からのグランザイムBの非侵襲的な光検出

Noninvasive optical detection of granzyme B from natural killer cells with enzyme-activated fluorogenic probes.

• Tomasz Janiszewski
• Sonia Kołt
• Dion Kaiserman
• Scott J Snipas
• Shuang Li
• Julita Kulbacka
• Jolanta Saczko
• Niels Bovenschen
• Guy Salvesen
• Marcin Drąg
• Phillip I Bird
• Paulina Kasperkiewicz

抄録

ナチュラルキラー（NK）細胞は、ウイルス感染と戦い、いくつかの癌のタイプを制御する重要な自然免疫エフェクターです。その免疫機能のために、ヒトのNK細胞は、グランザイム（A/B/H/K/M）と呼ばれる5種類の細胞傷害性プロテアーゼに大きく依存しています。グランザイムB（GrB）は、少なくとも3つの異なる細胞死経路を開始するが、その活性を検出する選択的なプローブが現在のところ不足しているため、その機能の重要な側面は未解明のままである。本研究では、非天然アミノ酸を用いてGrBの基質嗜好性を完全にマッピングし、これまで知られていなかったGrBの基質嗜好性を明らかにした。我々はその後、基質ベースの阻害剤とGrB活性化可能な活性ベースの蛍光プローブを設計するために、これらの嗜好性を使用しています。我々は、我々のGrBプローブがカスパーゼと有意に反応しないことを示し、細胞内のGrBの局在と機能の詳細な分析に理想的であることを示しています。我々の蛍光消光基質を用いて、ヒトYT細胞の細胞障害性顆粒内にGrBが存在することを観察した。細胞毒性エフェクターとして使用した場合、GrBを負荷したYT細胞はMDA-MB-231の標的細胞を攻撃し、活性化したGrBは標的細胞の殺傷効率に影響を与えた。以上のことから、我々は、NK 細胞における GrB の機能を調べるための一連の分子ツールを開発し、酵素活性化蛍光基質を用いて GrB を非侵襲的に視覚的に検出できることを実証した。

Natural killer (NK) cells are key innate immunity effectors that combat viral infections and control several cancer types. For their immune function, human NK cells rely largely on five different cytotoxic proteases, called granzymes (A/B/H/K/M). Granzyme B (GrB) initiates at least three distinct cell death pathways, but key aspects of its function remain unexplored because selective probes that detect its activity are currently lacking. In this study, we used a set of unnatural amino acids to fully map the substrate preferences of GrB, demonstrating previously unknown GrB substrate preferences. We then used these preferences to design substrate-based inhibitors and a GrB-activatable activity-based fluorogenic probe. We show that our GrB probes do not significantly react with caspases, making them ideal for in-depth analyses of GrB localization and function in cells. Using our quenched fluorescence substrate, we observed GrB within the cytotoxic granules of human YT cells. When used as cytotoxic effectors, YT cells loaded with GrB attacked MDA-MB-231 target cells, and active GrB influenced its target cell-killing efficiency. In summary, we have developed a set of molecular tools for investigating GrB function in NK cells and demonstrate noninvasive visual detection of GrB with an enzyme-activated fluorescent substrate.

© 2020 Janiszewski et al.