USP9Xは、ラット糸球体中隔膜細胞におけるNrf2-ARE経路の活性化を介して、AGEsによるFNおよびTGF-β1のアップレギュレーションを抑制する

USP9X prevents AGEs-induced upregulation of FN and TGF-β1 through activating Nrf2-ARE pathway in rat glomerular mesangial cells.

• Kaipeng Huang
• Xilin Zhao

抄録

酸化ストレスは、糸球体中隔細胞のTGF-β/Smad経路を活性化し、フィブロネクチン（FN）などの細胞外マトリックスの合成を促進することで、糖尿病性腎線維症の重要な病態因子となっています。核内因子-E2関連因子（Nrf2）-抗酸化応答エレメント（AREA）抗酸化経路は、重要な腎保護作用を有しており、ユビキチンを介したNrf2の分解を阻害することで、糖尿病性腎線維症の発症を遅らせることができます。ユビキチン特異的プロテアーゼ9X（USP9X）は、酸化ストレスやTGF-β/スマッド経路と密接な関係があるが、糖尿病性腎線維症を制御しているかどうかは明らかにされていない。本研究では、高度な糖化最終産物（AGEs）がGMCsにおけるUSP9Xのタンパク質発現とデユビキチナーゼ活性を用量と時間に依存して低下させることを明らかにした。USP9X の過剰発現は、AGEs による FN, TGF-β1, コラーゲンⅣ（線維化関連マーカー蛋白質）の発現亢進を、デユビキチナーゼ活性に依存した形で減衰させた。USP9XをsiRNAで枯渇させると、AGEs処理したGMCにおいて、これらのタンパク質の発現がさらに促進された。USP9Xの過剰発現は、AGEs処理条件下では、Nrf2の総量、核レベル、ARE結合能、転写活性を著しく増加させ、Nrf2下流遺伝子HO-1とNQO1のタンパク質発現をアップレギュレートし、最終的には過剰な活性酸素の産生を減少させた。また、脱ユビキチナーゼ触媒活性の低いUSP9X-C1556S変異体を過剰発現させても、このような効果は得られなかった。Nrf2をサイレンシングすると、USP9Xの腎保護効果は消失した。さらに、AGEs刺激によりNrf2が核内に移行し、USP9XとNrf2の相互作用が弱まることが示された。また、AGEsはNrf2のユビキチン化レベルを上昇させ、USP9X-C1556Sの代わりにUSP9Xを過剰発現させると、Nrf2のユビキチン化レベルが有意に低下した。以上のことから、USP9XはNrf2のユビキチン化レベルを低下させ、Nrf2-ARE経路の活性化を促進して細胞外マトリックスの蓄積を防ぎ、最終的には糖尿病性腎線維症の病態を緩和した。

Oxidative stress is a key pathological factor for diabetic renal fibrosis by activating TGF-β/Smad pathway in glomerular mesangial cells (GMCs) to promote the synthesis of extracellular matrix such as fibronectin (FN). Nuclear factor-E2-related factor (Nrf2)- anti-oxidant response element (ARE) anti-oxidative pathway has crucial renoprotective effects, and inhibiting ubiquitin-mediated degradation of Nrf2 delays diabetic renal fibrosis development. Ubiquitin-specific protease 9X (USP9X) has close relationship with oxidative stress and TGF-β/Smad pathway, but whether it regulate diabetic renal fibrosis remains unclarified. Here, we found that advanced glycation-end products (AGEs) dose- and time-dependently reduced the protein expression and deubiquitinase activity of USP9X in GMCs. USP9X overexpression attenuated AGEs-induced upregulation of FN, TGF-β1, and Collagen Ⅳ, three fibrosis-related marker proteins, in a deubiquitinase activity-dependent manner. While USP9X depletion with siRNAs further promoted the expressions of those proteins in AGEs-treated GMCs. Under AGEs treatment conditions, USP9X overexpression markedly increased the total and nuclear levels, ARE-binding ability, and transcriptional activity of Nrf2, upregulated the protein expressions of Nrf2 downstream genes HO-1 and NQO1, and eventually reduced the excessive production of ROS. Overexpression of the deubiquitinase catalytically inactive USP9X-C1556S mutant failed to exert such effects. Silencing Nrf2 abolished the renoprotective effects of USP9X. Further study showed that upon AGEs stimulation, Nrf2 transferred into the nucleus and the interaction between USP9X and Nrf2 was weakened. AGEs also increased Nrf2 ubiquitination level, and overexpression of USP9X, instead of USP9X-C1556S, significantly reduced the ubiquitination level of Nrf2. Taken together, USP9X reduced Nrf2 ubiquitination level and promoted Nrf2-ARE pathway activation to prevent the accumulation of extracellular matrix, eventually alleviated the pathological process of diabetic renal fibrosis.

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