メトホルミンの同定と妥当性の検証 トール様受容体経路を標的とすることでPM誘発マクロファージの細胞毒性を防御する

Identification and validation of metformin protects against PM-induced macrophages cytotoxicity by targeting toll like receptor pathway.

• Yanfeng Shi
• Josevata Werelagi Batibawa
• Modibo Maiga
• Baiyang Sun
• Yang Li
• Junchao Duan
• Zhiwei Sun

抄録

微粒子状物質（PM）は肺疾患の病態に関与していることが広く報告されている。近年、メトホルミンがPMの呼吸器・心血管障害を軽減することが報告されているが、その下降機序は明らかにされていない。本研究では、GEOデータベースのRNAseqプロファイルを用いて、メトホルミンの保護機能とアンダーリング機構を網羅的なバイオインフォマティクス解析と完全検証実験を行った。また、PM 毒性の鍵となるシグナル伝達系としての TLRs/MyD88/NF-κB 軸の機能を同定するために、edgeR、主成分分析（PCA）、K-Means クラスタリング、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）、GO、KEGG エンリッチメントを含む様々なバイオインフォマティクスツールを組み合わせて解析を行った。PMはTLRs/MyD88/NF-κB経路を活性化し、RAW264.7細胞においてIL-6, TNF-αの生成、ミトコンドリア損傷、細胞生存率の低下、LDH活性の増加をもたらした。メトホルミンは、TLRs/MyD88/NF-κB経路を制限することにより、IL-6産生、ミトコンドリア損傷、細胞生存率及びLDH活性を有意に減少させた。AMPKα2 に対する siRNA またはネガティブコントロールを RAW264.7 細胞にトランスフェクションし、メトホルミンが AMPKα2 依存的な方法で PM 誘導細胞毒性を保護しているかどうかを確認した。その結果、メトホルミンの前処理により、PM による細胞生存率の低下と LDH 活性の上昇が有意に抑制され、siControl 細胞と siAMPKα2 細胞の両方において TLRs/MyD88/NF-κB 経路が阻害された。以上の結果から、メトホルミンは、AMPKα2に依存しない方法でTLRs/MyD88/NF-κBシグナル伝達経路を阻害することで、PMが誘発するミトコンドリア損傷や細胞毒性から細胞を保護することが示唆された。

Fine particle matter (PM) has been extensively reported to contribute to the pathogenesis of pulmonary diseases. Recently, metformin has been reported to attenuate PM associated respiratory and cardiovascular injury, but the underling mechanism has not been discovered. Here, we performed comprehensively bioinformatics analysis and fully validation experiment to investigate the protection role of metformin and underling mechanism with RNAseq profile in GEO database. A combination of various bioinformatics tools including edgeR, principal component analysis (PCA), K-Means clustering, Gene Set Enrichment Analysis (GSEA), GO and KEGG enrichment were performed to identify the TLRs/MyD88/NF-κB axis functional as the key signaling transduction during PM associated toxicity. PM activated TLRs/MyD88/NF-κB pathway and resulted in significantly generation of IL-6, TNF-α, mitochondrial damage, decreasing of cell viability and increased LDH activity in RAW264.7 cells. Metformin significantly attenuated the production of IL-6, mitochondrial damage, cell viability and LDH activity by limiting TLRs/MyD88/NF-κB pathway. The siRNA against AMPKα2 or negative control were transfected to RAW264.7 cells to identify whether metformin protects PM-induced cytotoxicity in an AMPKα2-dependent manner. Pretreatment with metformin significantly attenuated PM induced decreasing of cell viability and increased LDH activity, as well as inhibited the TLRs/MyD88/NF-κB pathway in both siControl or siAMPKα2 cells. Taken together, our results indicate that metformin protects against PM-induced mitochondrial damage and cell cytotoxicity by inhibiting TLRs/MyD88/NF-κB signaling pathway in an AMPKα2 independent manner.

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