血漿中ロイコトリエンEを定量するための高感度液体クロマトグラフィー質量分析法を開発し、ヒトにおける内因性5-LO経路活性の薬理学的抑制を実証した

Development of a highly sensitive liquid chromatography-mass spectrometry method to quantify plasma leukotriene E and demonstrate pharmacological suppression of endogenous 5-LO pathway activity in man.

• Lars Löfgren
• Gun-Britt Forsberg
• Pia Davidsson
• Susanna Eketjäll
• Carl Whatling

抄録

ヒト血漿中の 5-リポキシゲナーゼ (5-LO) パスウェイのバイオマーカーであるロイコトリエン E (LTE) の基底内因性濃度が低い (20 pg/mL 未満) ことは、分析上の大きな課題となっています。これまで血漿中のLTEの定量には、液体クロマトグラフィー質量分析法や酵素連結免疫吸着法などの分析法が用いられてきましたが、低pg/mLレンジでの一貫したデータは得られていませんでした。今回開発した新しい方法では、大容量のサンプル精製とアニオン交換混相固相抽出（SPE）による濃縮と大容量注入を組み合わせ、超高性能液体クロマトグラフィー（UPLC）によるクロマトグラフィー分離と高感度負イオンエレクトロスプレータンデム質量分析法（MS/MS）による定量を行うことで、LTEの検出限界（血漿中1pg/mL未満）を有意に下回る値を得ることができました。この方法は、1～120 pg/mLの血漿LTEの間で再現性があり、正確で直線的であった。この方法は、FLAP（5-リポキシゲナーゼ活性化タンパク質）阻害剤AZD5718を使用した第1相試験において、健康なボランティアから採取した血漿サンプルの分析に使用されました。健康なボランティア（n = 34）では、5.1 ± 2.7 pg/mLの基本的な内因性LTEレベルが観察されました。AZD5718を単回経口投与した被験者では、血漿中LTE濃度が80%以上の有意な抑制が観察され、内因性5-LO経路活性を評価できる薬理学的証拠となった。

Low basal endogenous concentrations (<20 pg/mL) of the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway biomarker leukotriene E (LTE) in human plasma present a significant analytical challenge. Analytical methods including liquid chromatography-mass spectrometry and enzyme linked immunosorbent assays have been used to quantify plasma LTE in the past but have not provided consistent data in the lower pg/mL-range. With our new method, a detection limit (<1 pg/mL plasma) significantly below basal levels of LTE was achieved by combining large volume sample purification and enrichment by anion-exchange mixed mode solid phase extraction (SPE) with large volume injection followed by chromatographic separation by ultra performance liquid chromatography (UPLC) and quantification by highly sensitive negative-ion electrospray tandem mass spectrometry (MS/MS). The method was reproducible, accurate and linear between 1 and 120 pg/mL plasma LTE. The method was used to perform an analysis of plasma samples collected from healthy volunteers in a Phase 1 study with the FLAP (5-lipoxygenase activating protein) inhibitor AZD5718. Basal endogenous LTE levels of 5.1 ± 2.7 pg/mL were observed in healthy volunteers (n = 34). In subjects that had been administered a single oral dose of AZD5718, significant suppression (>80%) of plasma LTE level was observed, providing pharmacological evidence that endogenous 5-LO pathway activity could be assessed.

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