カドミウム硫化物ナノ粒子をベースとした新規コンジュゲートによる無細胞系で発現するヒトp53のin-vitro検出

Detection of Human p53 In-Vitro Expressed in a Transcription-Translation Cell-Free System by a Novel Conjugate Based on Cadmium Sulphide Nanoparticles.

• Víctor Barba-Vicente
• María Jesús Almendral Parra
• Juan Francisco Boyero-Benito
• Carlota Auría-Soro
• Pablo Juanes-Velasco
• Alicia Landeira-Viñuela
• Álvaro Furones-Cuadrado
• Ángela-Patricia Hernández
• Raúl Manzano-Román
• Manuel Fuentes

抄録

ここでは、硫化カドミウム量子ドット（CdS QD）を合成し、ウシ血清アルブミン（BSA）とコロイド水溶液中で機能化し、3ヶ月以上の安定性を実現した。均質相で低温での特定の合成条件により、S濃度を制限することができ、その結果、ナノ粒子（NP）の成長が制限されました。この事実は、生体分子のための最も有利な方法でBSAとの結合を可能にします。CdSナノ粒子の表面上のカドミウムイオンの存在は、凝集のためのほとんどの傾向を持つ小さなNPの形成、その結果、BSAの負に帯電したドメインによって打ち消されています。温度とpHは、合成されたナノ粒子の蛍光特性に大きな影響を与える。低温(4℃)とpH10-11での作業は、Sイオンのチオアセトアミド前駆体の加水分解速度制御によって示されるように、最良の結果を示した。結合BSAの生物学的活性は、抗体のような他の生体分子とのその後のバイオコンジュゲーションを可能にするために維持されています。抗グルタチオンS-トランスフェラーゼ（α-GST）抗体との化学的共役は、ヒトの組換え融合タンパク質で採用されている一般的なタグは、生物学的標識での使用の可能性を証明する強力な蛍光の消光を生成します。最後に、ヒト組換えタンパク質p53（COOH末端にGSTタグを持つ）をin situ IVTT（in vitro転写翻訳）で発現させ、α-GST-CdS QDコンジュゲートで効率的に捕捉した結果、IVTTシステム上での生体適合性とコンジュゲート抗体の機能性を実証した。

Here, cadmium sulphide quantum dots (CdS QDs) have been synthetized and functionalized with Bovine Serum Albumin (BSA) in a colloidal aqueous solution with a stability of over 3 months. Specific synthesis conditions, in homogeneous phase and at low temperature, have allowed limitation of S concentration, hence, as a consequence, there is restricted growth of the nanoparticles (NPs). This fact allows binding with BSA in the most favorable manner for the biomolecule. The presence of Cd ions on the surface of the CdS nanoparticle is counteracted by the negatively charged domains of the BSA, resulting in the formation of small NPs, with little tendency for aggregation. Temperature and pH have great influence on the fluorescence characteristics of the synthetized nanoparticles. Working at low temperatures (4 °C) and pH 10-11 have proven the best result as shown by hydrolysis kinetic control of the thioacetamide precursor of S ion. Biological activity of the coupled BSA is maintained allowing subsequent bioconjugation with other biomolecules such as antibodies. The chemical conjugation with anti-Glutathione S-transferase (α-GST) antibody, a common tag employed in human recombinant fusion proteins, produces a strong quenching of fluorescence that proves the possibilities of its use in biological labelling. Finally, p53, onco-human recombinant protein (GST tagged in COOH terminus), has been in situ IVTT (in vitro transcription-translation) expressed and efficiently captured by the α-GST-CdS QD conjugate as a proof of the biocompatibility on IVTT systems and the functionality of conjugated antibody.