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ウシルーメンのTRPV3チャネル：ウシルーメンのアンモニア輸送に関連するタンパク質の局在と機能的特徴
The TRPV3 channel of the bovine rumen: localization and functional characterization of a protein relevant for ruminal ammonia transport.
PMID: 32458085 PMCID: PMC7293678. DOI: 10.1007/s00424-020-02393-2.
抄録
大量のアンモニア（NHまたはNH）が腸から吸収され、肝疾患の脳炎、家畜のタンパク質効率の低下、および窒素性気候ガスの排出と関連している。その輸送機構の解明が急務となっている。最近の機能的およびmRNAデータから、牛の森林胃からのアンモニアの吸収にはTRPV3チャネルが関与している可能性が示唆されている。本研究の目的は、TRPV3 のウシホモログ（bTRPV3）の塩基配列を決定し、そのタンパク質をウシの鼻腔組織に局在させ、NH の輸送を確認することであった。配列決定後、HEK-293 細胞および Xenopus 卵母細胞で bTRPV3 が過剰発現していることを確認した。エピトープスクリーニングにより抗体を選択し、過剰発現細胞とウシルーメンのイムノブロットでタンパク質を検出するために使用し、予測された〜90 kDaのシグナルを明らかにした。ルーメンのみでは、さらに60 kDaのバンドが出現し、これは以前に記載された同じ長さのbTRPV3スプライスバリアントを表している可能性があります。免疫組織化学的には、鼻筋基底層から肉芽層までの染色が認められた。pH感受性のある微小電極を用いた測定から、NHはXenopusの卵母細胞を酸性化させ、bTRPV3の過剰発現はNHへの透過性を高めることが示された。単一チャンネルの測定から、Xenopus卵母細胞は内因性の小陽イオンチャネルに加えて、bTRPV3の発現後にのみ観察される4倍の大きさの小陽イオンチャネルを発現していることが明らかになった。内因性チャネルとbTRPV3チャネルの両方がNH, Na, Kを伝導していた。先行研究のデータと合わせて、Na, Ca, NHの輸送に役割があることが明らかになった。牛のカルシウムホメオスタシス、鼻腔pH、窒素効率への影響が議論されている。
Large quantities of ammonia (NH or NH) are absorbed from the gut, associated with encephalitis in hepatic disease, poor protein efficiency in livestock, and emissions of nitrogenous climate gasses. Identifying the transport mechanisms appears urgent. Recent functional and mRNA data suggest that absorption of ammonia from the forestomach of cattle may involve TRPV3 channels. The purpose of the present study was to sequence the bovine homologue of TRPV3 (bTRPV3), localize the protein in ruminal tissue, and confirm transport of NH. After sequencing, bTRPV3 was overexpressed in HEK-293 cells and Xenopus oocytes. An antibody was selected via epitope screening and used to detect the protein in immunoblots of overexpressing cells and bovine rumen, revealing a signal of the predicted ~ 90 kDa. In rumen only, an additional ~ 60 kDa band appeared, which may represent a previously described bTRPV3 splice variant of equal length. Immunohistochemistry revealed staining from the ruminal stratum basale to stratum granulosum. Measurements with pH-sensitive microelectrodes showed that NH acidifies Xenopus oocytes, with overexpression of bTRPV3 enhancing permeability to NH. Single-channel measurements revealed that Xenopus oocytes endogenously expressed small cation channels in addition to fourfold-larger channels only observed after expression of bTRPV3. Both endogenous and bTRPV3 channels conducted NH, Na, and K. We conclude that bTRPV3 is expressed by the ruminal epithelium on the protein level. In conjunction with data from previous studies, a role in the transport of Na, Ca, and NH emerges. Consequences for calcium homeostasis, ruminal pH, and nitrogen efficiency in cattle are discussed.