トウモロコシ C4-ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのグルコース 6-リン酸アロステリック部位の構造と生化学的証拠：酵素全体のキネティクスにおけるその重要性

Structural and biochemical evidence of the glucose 6-phosphate-allosteric site of maize C4-phosphoenolpyruvate carboxylase: its importance in the overall enzyme kinetics.

• Rosario A Muñoz-Clares
• Lilian González-Segura
• Javier Andrés Juárez-Díaz
• Carlos Mújica-Jiménez

抄録

グルコース6-リン酸(G6P)や他のリン酸糖によるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(PEPC)酵素の活性化は、生理学的に重要な関連性を持っています。しかし、G6Pとアロステリックサイトの存在は疑問視されており、G6Pが活性部位に結合することで基質であるホモトロピック効果を発揮する競合的活性化が提案されていた。ここでは、これまでに提案されていたアロステリック部位にG6Pがよく結合したゼニアメイ由来のPEPC-C4アイソザイムの結晶構造を報告し、その存在を明確に確認した。その機能性を調べるために、G6Pとタンパク質の相互作用の網に関与するAsp239をアラニンに変更した。D239A変異体はG6Pによって活性化されず、逆に阻害された。阻害は野生型酵素でも活性化をもたらす濃度よりも高いG6P濃度で観察され、おそらくPEPと競合して活性部位にG6Pが結合することに起因していると考えられる。基質である PEP の活性と協調性の低下、グリシンによる活性化の低下、リンゴ酸に対する反応の低下は、D239A 変異体では、フリー PEP の異種間性アロステリックな活性化効果も廃止されていることを示唆しています。これらの知見は、G6P-アロステリック部位の存在と、リン酸化された化合物によるPEPC酵素の活性化のためのその本質の両方と一致している。さらに、我々の知見は、G6Pや他のリン酸化糖が存在しない場合でも、G6P-アロステリック部位が遊離PEPによる活性化に関与していることから、これらの酵素の全体的な速度論においてG6P-アロステリック部位が中心的な役割を果たしていることを示唆している。

Activation of phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) enzymes by glucose 6-phosphate (G6P) and other phospho-sugars is of major physiological relevance. Previous kinetic, site-directed mutagenesis and crystallographic results are consistent with allosteric activation, but the existence of a G6P-allosteric site was questioned and competitive activation-in which G6P would bind to the active site eliciting the same positive homotropic effect as the substrate phosphoenolpyruvate (PEP)-was proposed. Here, we report the crystal structure of the PEPC-C4 isozyme from Zea mays with G6P well bound into the previously proposed allosteric site, unambiguously confirming its existence. To test its functionality, Asp239-which participates in a web of interactions of the protein with G6P-was changed to alanine. The D239A variant was not activated by G6P but, on the contrary, inhibited. Inhibition was also observed in the wild-type enzyme at concentrations of G6P higher than those producing activation, and probably arises from G6P binding to the active site in competition with PEP. The lower activity and cooperativity for the substrate PEP, lower activation by glycine and diminished response to malate of the D239A variant suggest that the heterotropic allosteric activation effects of free-PEP are also abolished in this variant. Together, our findings are consistent with both the existence of the G6P-allosteric site and its essentiality for the activation of PEPC enzymes by phosphorylated compounds. Furthermore, our findings suggest a central role of the G6P-allosteric site in the overall kinetics of these enzymes even in the absence of G6P or other phospho-sugars, because of its involvement in activation by free-PEP.

© 2020 The Author(s). Published by Portland Press Limited on behalf of the Biochemical Society.