繊毛におけるアルギニンキナーゼの役割。繊毛におけるAK3の細胞内局在とホスホアルギニンシャトルシステム

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Eur. J. Protistol..2020 Jun;74:125705. S0932-4739(20)30035-3. doi: 10.1016/j.ejop.2020.125705.Epub 2020-04-23.

繊毛におけるアルギニンキナーゼの役割。繊毛におけるAK3の細胞内局在とホスホアルギニンシャトルシステム

Role of arginine kinase in Paramecium tetraurelia (Ciliophora, Peniculida): Subcellular localization of AK3 and phosphoarginine shuttle system in cilia.

Daichi Yano
Ryouji Funadani
Kouji Uda
Tatsuomi Matsuoka
Tomohiko Suzuki

PMID: 32464434 DOI: 10.1016/j.ejop.2020.125705.

抄録

繊毛虫テトラウレアには、4 つのアルギニンキナーゼ遺伝子（AK1, AK2, AK3, AK4）が存在する。これらの遺伝子のうち、ファルネシル化のシグナル配列を持つのはAK3のみであり、翻訳後に修飾された酵素が毛様体膜に固定されることを可能にする。この修飾を確認するために、無細胞タンパク質合成系を用いてAK3を合成し、ペプチドマスフィンガープリンティング（PMF）を用いてペプチド質量を解析した。PMF分析の結果、AK3のC末端ペプチドはファルネシル化されていることがわかった。このことから、AK3は生理的に適切な条件下でファルネシル化される可能性があることが示唆された。P. tetraurelia AK3の細胞内局在を決定するために、インタクト細胞および毛様体画分から抽出したタンパク質に対するAK3ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析を行った。Triton X-100 を用いて抽出したところ、毛様体画分から AK3 が検出された。この結果から、毛様体画分にはAK3が含まれていることが示唆された。また、P. tetraurelia AKの毛様体運動における役割を、摂食RNA干渉法を用いて調べた。その結果、AK1-およびAK3サイレンスを受けた細胞の泳動速度は、対照細胞の半分の値にまで有意に低下した。以上のことから、P. tetraurelia AK3は毛様体膜に存在し、おそらく毛様体に存在するホスホアルギニンシャトルシステムを介して遊泳速度に影響を与えていると考えられる。

The ciliate Paramecium tetraurelia has four arginine kinase genes (AK1, AK2, AK3, and AK4). Of these genes, only AK3 has a signal sequence for farnesylation, a post-translational modification that enables anchoring of the modified enzyme to the ciliary membrane. To confirm this modification, AK3 was synthesized using a cell-free protein synthesis system and the peptide masses were analyzed using peptide mass fingerprinting (PMF). The PMF analysis indicated that the C-terminal peptide of AK3 is farnesylated. Thus, AK3 can be farnesylated under physiologically appropriate conditions. To determine the subcellular localization of P. tetraurelia AK3, Western blot analysis was performed using an AK3 polyclonal antibody for the proteins extracted from intact cells and ciliary fractions. When extraction was performed using Triton X-100, AK3 was detected the ciliary fraction. This result suggested that the ciliary fraction contains AK3. In addition, we investigated the role of P. tetraurelia AKs in ciliary movement using the feeding RNA interference method. The swimming velocity of AK1- and AK3-silenced cells was significantly reduced to half the value of that control cells. In summary, P. tetraurelia AK3 is likely to be located in the ciliary membrane and influences swimming velocity, presumably through the phosphoarginine shuttle system present in cilia.