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ORF4とORF5aの間に挿入されたマーカー遺伝子を発現するブタの生殖・呼吸器症候群ウイルスの生成
Generation of a porcine reproductive and respiratory syndrome virus expressing a marker gene inserted between ORF4 and ORF5a.
PMID: 32474688 DOI: 10.1007/s00705-020-04679-3.
抄録
近年、ブタ生殖・呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）の逆遺伝学的システムが利用可能になったことにより、発現ベクターとしての組換えウイルスの使用に新たな展望が生まれた。これらの組換えPRRSVベクターのほとんどは、ORF1bとORF2、またはORF7と3'UTRに挿入された独立した転写ユニットを介して外来遺伝子を発現している。本研究の目的は、PRRSVゲノムへの外来遺伝子挿入の代替部位を見つけることであった。ここでは、細胞に適応したPRRSV株GXNN1396-P96の感染性cDNAクローンを構築した。このcDNAクローン由来の組換えウイルス（rGXAM）は、MARC-145細胞内での増殖速度が親ウイルスGX1396-P96と同等であった。この感染性cDNAクローンを用いて、ORF4とORF5aに独立した転写ユニットを挿入し、緑色蛍光タンパク質（GFP）遺伝子を発現する新規PRRSVベースの組換えウイルスを作製した。この組換えウイルスの生物学的特性を調べたところ、GX45BSTRS-GFPは同じような増殖特性を維持しながら、親のPRRSVよりも少ない感染性ウイルスを産生することがわかった。これらのデータは、ORF4およびORF5a部位が外来遺伝子の挿入に耐えられることを示している。
In recent years, the availability of reverse genetics systems for porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) has created new perspectives for the use of recombinant viruses as expression vectors. Most of these recombinant PRRSV vectors express foreign genes through either an independent transcription unit inserted in ORF1b and ORF2, or in ORF7 and the 3' UTR. The aim of this study was to find an alternative site for foreign gene insertion into the PRRSV genome. Here, we constructed an infectious cDNA clone for a cell-adapted PRRSV strain, GXNN1396-P96. This cDNA-clone-derived recombinant virus (rGXAM) was comparable in its growth kinetics in MARC-145 cells to the parental virus, GX1396-P96. Using the infectious cDNA-clone, we inserted an independent transcription unit in ORF4 and ORF5a to generate a novel PRRSV-based recombinant virus expressing the green fluorescent protein (GFP) gene. Biological characterization of the recombinant virus, rGX45BSTRS-GFP, showed that it maintained similar growth characteristics but produced fewer infectious virions than the parental PRRSV. These data demonstrate that the ORF4 and ORF5a site is able to tolerate the insertion of foreign genes.