プロサバイバルキナーゼのミトコンドリア内局在の違いとDUSP5とPHLPP-1による機能制御

Distinct intra-mitochondrial localizations of pro-survival kinases and regulation of their functions by DUSP5 and PHLPP-1.

• Wataru Ohwada
• Masaya Tanno
• Toshiyuki Yano
• Sang-Bing Ong
• Koki Abe
• Tatsuya Sato
• Atsushi Kuno
• Takayuki Miki
• Hirohito Sugawara
• Yusuke Igaki
• Tetsuji Miura

抄録

ERKとAktは、ミトコンドリア透過性遷移閾値の主要なモジュレーターであるGSK-3βをリン酸化することで、死を誘発するストレスに対する細胞の感受性を制御していることが示されている。本研究では、生存促進キナーゼのミトコンドリア内局在性とホスファターゼによる制御を調べた。HEK293細胞またはH9c2細胞から分離したミトコンドリアを段階的にトリプシン消化し、免疫ブロッティングを行ったところ、GSK-3βとERKは外膜（OM）に支配的に局在し、AktはOM、内膜（IM）、マトリックスに同程度のレベルで存在していることが明らかになった。IGF-1の投与により、マトリックスではAktの蛋白質レベルが上昇し、OMではERKとGSK-3βの蛋白質レベルが上昇した。同時に、IGF-1の投与は、IMとマトリックスのThr202/Tyr204-phospho-ERKのレベルを上昇させ、OM、IM、マトリックスのSer473-phospho-AktとSer9-phospho-GSK-3βのレベルを上昇させた。アンチマイシンAを用いて活性酸素に曝露すると、主にOMでDUSP5とPHLPP-1のレベルが上昇し、Akt、ERK、GSK-3βの脱リン酸化が誘導された。DUSP5のミトコンドリア局在性は、Percoll勾配遠心法で精製したミトコンドリアを用いた実験や、GFPタグを付けたDUSP5を細胞にトランスフェクションした実験で確認された。DUSP5またはPHLPP-1のいずれかのノックダウンは、ミトコンドリア中のThr202/Tyr204-phospho-ERKおよびSer473-phospho-Aktの両方のレベルを増加させた。アンチマイシンAによって誘導された細胞死は、DUSP5のsiRNAを介したノックダウンによって抑制された。以上の結果から、ミトコンドリアにおけるAktとERKはミトコンドリア内で異なる局在性を示し、GSK-3βの制御においてクロストークを示すこと、DUSP5とPHLPP-1のミトコンドリアへのリクルートが活性酸素による防御シグナル伝達の停止に寄与していることが示唆された。

ERK and Akt have been shown to regulate cell sensitivity to death-inducing stress by phosphorylating GSK-3β, a major modulator of the threshold for mitochondrial permeability transition. Here we examined intra-mitochondrial localization of the pro-survival kinases and their regulation by phosphatases. Stepwise trypsin digestion of mitochondria isolated from HEK293 or H9c2 cells was performed, and immunoblotting revealed that GSK-3β and ERK localized dominantly in the outer membrane (OM), while Akt resided at comparable levels in OM, the inner membrane (IM) and the matrix. Treatment with IGF-1 increased the protein level of Akt in the matrix, while ERK and GSK-3β protein levels were increased in OM. Simultaneously, IGF-1 treatment elevated the level of Thr202/Tyr204-phospho-ERK in IM and matrix and levels of Ser473-phospho-Akt and Ser9-phospho-GSK-3β in OM, IM and matrix. Exposing cells to reactive oxygen species (ROS) by using antimycin A increased the levels of DUSP5 and PHLPP-1 mainly in OM and induced dephosphorylation of Akt, ERK and GSK-3β. The mitochondrial localization of DUSP5 was confirmed by experiments with mitochondria purified by Percoll gradient centrifugation and by transfection of cells with GFP-tagged DUSP5. Knockdown of either DUSP5 or PHLPP-1 increased the levels of both Thr202/Tyr204-phospho-ERK and Ser473-phospho-Akt in mitochondria. Cell death induced by antimycin A was suppressed by siRNA-mediated knockdown of DUSP5. The results suggest that Akt and ERK in mitochondria show distinct intra-mitochondrial localization and crosstalk in GSK-3β regulation and that recruitment of DUSP5 as well as PHLPP-1 to mitochondria contributes to ROS-induced termination of the protective signaling.

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