より速く、より鋭く、より正確に。前臨床試験における自動化されたCluster-FLIMは、生きた細胞や組織におけるセラノスティックスの細胞内運命を直接識別します

Faster, sharper, more precise: Automated Cluster-FLIM in preclinical testing directly identifies the intracellular fate of theranostics in live cells and tissue.

• Robert Brodwolf
• Pierre Volz-Rakebrand
• Johannes Stellmacher
• Christopher Wolff
• Michael Unbehauen
• Rainer Haag
• Monika Schäfer-Korting
• Christian Zoschke
• Ulrike Alexiev

抄録

蛍光顕微鏡は、2D細胞培養や3Dモデルにおける高含有量スクリーニングに広く使用されています。特に、3D組織モデルは、現代の医薬品開発において大きな意味を持つようになってきています。複雑なサンプルの直接的なマルチパラメトリック評価を可能にする蛍光寿命イメージング（FLIM）は、微小環境に対する蛍光寿命の感度により、強度イメージングにさらなるレベルを追加します。しかし、FLIMの使用は、特に生細胞内で光毒性の影響を受けずに十分な光子数を取得することに制限があります。本研究では、蛍光寿命情報を薬理経路に正確に変換するための洞察力を高め、分析と測定時間を大幅に短縮するためのクラスターベースの新しい解析手法を開発した。データのフィッティングフリーのCluster-FLIM解析による感度と特異性の評価に続いて、細胞内分子の取り込みと細胞内相互作用のダイナミクスを評価しました。3Dライブ組織の調査には、多光子(mp)FLIMを適用しました。Cluster-FLIMの統計学に基づいたフィッティングフリー解析により、自動化のためにこのアプローチを利用しました。 単一カラーチャンネル内の5つの異なる蛍光種の蛍光寿命シグネチャを識別するために、Cluster-FLIM法は、95%の感度（ヒット率）と95%の特異度（正解率）を得るために、1ピクセルあたりそれぞれ170、90カウントしか必要としません。Cluster-FLIMはMOIの細胞内相互作用を明らかにし、その時空間的な細胞内運命を表現しました。自動化されたワークフローの設定では、MOIのリソソソーム捕捉の評価により、正常細胞と腫瘍細胞、および2Dモデルと3Dモデルの間の関連する違いが明らかになりました。これにより、Cluster-FLIMは、創薬開発やそれ以降の標的分子の高含量分析におけるFLIMの適用性を高めます。

Fluorescence microscopy is widely used for high content screening in 2D cell cultures and 3D models. In particular, 3D tissue models are gaining major relevance in modern drug development. Enabling direct multiparametric evaluation of complex samples, fluorescence lifetime imaging (FLIM) adds a further level to intensity imaging by the sensitivity of the fluorescence lifetime to the microenvironment. However, the use of FLIM is limited amongst others by the acquisition of sufficient photon numbers without phototoxic effects in live cells. Herein, we developed a new cluster-based analysis method to enhance insight, and significantly speed up analysis and measurement time for the accurate translation of fluorescence lifetime information into pharmacological pathways. : We applied a fluorescently-labeled dendritic core-multishell nanocarrier and its cargo Bodipy as molecules of interest (MOI) to human cells and reconstructed human tissue. Following the sensitivity and specificity assessment of the fitting-free Cluster-FLIM analysis of data and , we evaluated the dynamics of cellular molecule uptake and intracellular interactions. For 3D live tissue investigations, we applied multiphoton (mp) FLIM. Owing to Cluster-FLIM's statistics-based fitting-free analysis, we utilized this approach for automatization. : To discriminate the fluorescence lifetime signatures of 5 different fluorescence species in a single color channel, the Cluster-FLIM method requires only 170, respectively, 90 counts per pixel to obtain 95% sensitivity (hit rate) and 95% specificity (correct rejection rate). Cluster-FLIM revealed cellular interactions of MOIs, representing their spatiotemporal intracellular fate. In a setting of an automated workflow, the assessment of lysosomal trapping of the MOI revealed relevant differences between normal and tumor cells, as well as between 2D and 3D models. : The automated Cluster-FLIM tool is fitting-free, providing images with enhanced information, contrast, and spatial resolution at short exposure times and low fluorophore concentrations. Thereby, Cluster-FLIM increases the applicability of FLIM in high content analysis of target molecules in drug development and beyond.

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