Aspergillus oryzaeにおけるゲノム共編集のための新規ピリチアミン耐性マーカー遺伝子ThiIの同定

Identification of a novel pyrithiamine resistance marker gene thiI for genome co-editing in Aspergillus oryzae.

• Takehiko Todokoro
• Hiroki Bando
• Atsushi Kotaka
• Hiroko Tsutsumi
• Yoji Hata
• Hiroki Ishida

抄録

微生物の遺伝子改変やゲノム編集にはマーカー遺伝子が不可欠である。酵素生産の宿主として広く利用されているAspergillus oryzaeでは、陽性選択に利用できるマーカー遺伝子はわずかである。これらの遺伝子の一つであるピリチアミン（PT）耐性マーカー遺伝子ThiAは、その特異的な耐性付与機構のため、CRISPR/Cas9ゲノム編集には有用ではない。本研究では、新規なPT耐性マーカーをゲノム編集への応用の可能性を考慮して検討した。紫外線変異原化したA. oryzae RIB40からPT耐性変異体を選択した。この突然変異体について全ゲノム解析を行い、新規なPT耐性候補遺伝子を同定した。この候補遺伝子は、Schizosaccharomyces pombeのチアミントランスポーター遺伝子thi9と類似性を示し、thiIと命名された。また、CRISPR/Cas9 ゲノム編集システムを用いて thiI 機能低下変異体を作製し、PT 耐性への影響を調べた。この変異体はPT抵抗性を示し、成長障害や補助萎縮を示さなかった。さらに、ThiI遺伝子をゲノム共編集における選択マーカーとして利用するための研究を行った。その結果、ThiI 遺伝子と標的遺伝子の二重機能喪失変異体を PT 含有培地上で効率的に選択することができ、ThiI は A.oryzae のゲノム編集に有用なマーカー遺伝子であることが示された。本研究は、A.oryzaeの基礎研究や産業応用につながる知見を提供するものと期待される。

Marker genes are essential for gene modification and genome editing of microorganisms. In Aspergillus oryzae, a widely used host for enzyme production, only a few marker genes can be used for positive selection. One of these genes, the pyrithiamine (PT) resistance marker gene thiA, is not useful for CRISPR/Cas9 genome editing because of its unique resistance-conferring mechanism. In this study, a novel PT resistance marker was investigated considering its potential applications in genome editing. A mutant resistant to PT was selected from UV-mutagenized A. oryzae RIB40. Whole genome analysis was conducted on the mutants, and a novel candidate gene for PT resistance was identified. This candidate gene exhibited similarity to the thiamine transporter gene thi9 of Schizosaccharomyces pombe and was designated as thiI. A thiI loss-of-function mutant was generated using the CRISPR/Cas9 genome editing system to investigate its effect on PT resistance. This mutant showed PT resistance and exhibited no growth defect or auxotrophy. The thiI gene was further investigated for its use as a selection marker in genome co-editing. Ribonucleoprotein complex comprising recombinant Cas9 nuclease and sgRNA targeting thiI or another target gene (wA or sreA) was prepared and simultaneously introduced into A. oryzae RIB40. thiI and target gene double loss-of-function mutants were efficiently selected on PT-containing medium. thiI was shown to be a useful marker gene in A. oryzae for use in genome editing. This study is expected to provide insights, which will promote basic research and industrial applications of A. oryzae.

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