グリコシダーゼ触媒におけるエポキシド中間体

An Epoxide Intermediate in Glycosidase Catalysis.

• Lukasz F Sobala
• Gaetano Speciale
• Sha Zhu
• Lluís Raich
• Natalia Sannikova
• Andrew J Thompson
• Zalihe Hakki
• Dan Lu
• Saeideh Shamsi Kazem Abadi
• Andrew R Lewis
• Víctor Rojas-Cervellera
• Ganeko Bernardo-Seisdedos
• Yongmin Zhang
• Oscar Millet
• Jesús Jiménez-Barbero
• Andrew J Bennet
• Matthieu Sollogoub
• Carme Rovira
• Gideon J Davies
• Spencer J Williams

抄録

保持グリコシドヒドロラーゼは、アノマー位置での立体化学的保持により基質を切断します。一般的に、これは共有結合型グリコシル酵素中間体を介した酵素的求核剤、またはオキサゾリン中間体を介した基質媒介2-アセタミド隣接基による隣接基の参加のいずれかを使用して2段階のメカニズムを伴う;糖2-ヒドロキシルの参加を伴う酵素的メカニズムは報告されていません。ここでは、グリコシドヒドロラーゼファミリー99 -α-1,2-マンナナーゼにおけるマンノース2-ヒドロキシルによる隣接基参加の構造、計算、および速度論的証拠を詳述する。我々は、反応座標に沿ってキー種の一連の結晶学的スナップショットを提示します：四糖基質とミケリス錯体;中間体模倣、糖型サイリトールβ-1,2-アジリジンとβ-1,2-エポキシドとの錯体;および生成物錯体。1,2-エポキシド中間体模倣体は、1,2-アンヒドロ糖中間体に期待される加水分解および移動反応性に類似した反応性を示し、その触媒的等価性を支持した。反応座標の量子力学/分子力学のモデリングは、異常に平坦化された、エンベロープ（）コンフォメーションの遷移状態を介して1,2-アンヒドロ糖を介して反応経路を予測した。アノメリック-Hおよびアノメリック-Cの速度論的同位体効果(/)はオキソカルベニウムイオン様の遷移状態を支持し、C2-Oの速度論的同位体効果(1.052±0.006)はC2-ヒドロキシルによる求核的な参加を直接的に示唆している。これらのデータは、この前例のない、長い間想像されていた酵素機構を実証するものである。

Retaining glycoside hydrolases cleave their substrates through stereochemical retention at the anomeric position. Typically, this involves two-step mechanisms using either an enzymatic nucleophile via a covalent glycosyl enzyme intermediate or neighboring-group participation by a substrate-borne 2-acetamido neighboring group via an oxazoline intermediate; no enzymatic mechanism with participation of the sugar 2-hydroxyl has been reported. Here, we detail structural, computational, and kinetic evidence for neighboring-group participation by a mannose 2-hydroxyl in glycoside hydrolase family 99 -α-1,2-mannanases. We present a series of crystallographic snapshots of key species along the reaction coordinate: a Michaelis complex with a tetrasaccharide substrate; complexes with intermediate mimics, a sugar-shaped cyclitol β-1,2-aziridine and β-1,2-epoxide; and a product complex. The 1,2-epoxide intermediate mimic displayed hydrolytic and transfer reactivity analogous to that expected for the 1,2-anhydro sugar intermediate supporting its catalytic equivalence. Quantum mechanics/molecular mechanics modeling of the reaction coordinate predicted a reaction pathway through a 1,2-anhydro sugar via a transition state in an unusual flattened, envelope () conformation. Kinetic isotope effects (/) for anomeric-H and anomeric-C support an oxocarbenium ion-like transition state, and that for C2-O (1.052 ± 0.006) directly implicates nucleophilic participation by the C2-hydroxyl. Collectively, these data substantiate this unprecedented and long-imagined enzymatic mechanism.

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