ヒスチジンキナーゼFRETセンサーの設計と生体内での複雑なシグナル統合を検出するためのヒスチジンキナーゼFRETセンサーの設計

Design of a Histidine Kinase FRET Sensor to Detect Complex Signal Integration within Living Bacteria.

• Samuel W Duvall
• W Seth Childers

抄録

ヒスチジンキナーゼ（HK）は、キナーゼとホスファターゼの活性を促進するコンフォメーション状態を切り替えて、多様な細胞プロセスを制御しています。これまでの研究により、これらの機能状態は微生物群集内の細胞間で不均一性を示し、細胞レベルで変化しうることが示されている。キナーゼのコンフォメーション状態を追跡し、生きた細菌細胞の表現型応答と相関させる方法は、細菌のシグナル伝達機構を解明する新たな機会を提供するものである。このような構造変化を検出するための蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）センサーとして、細胞周期HK CckAにmClover3（ドナー）とmRuby3（アクセプター）の両方の蛍光タンパク質を組み込んでみました。我々が設計した FRET センサーは CckA 固有の入力信号に応答し、細胞の発達に伴って起こる CckA 信号の統合における細胞内の変化を検出した。我々は、CckA FRET センサーを HK 阻害剤のスクリーニングツールとして使用できる可能性を実証した。要約すると、我々は、生きている細菌の広範なシグナル伝達機構を調べるための変化をモニターするために採用することができる新しいHK FRETセンサーの設計戦略を開発した。

Histidine kinases (HK) switch between conformational states that promote kinase and phosphatase activities to regulate diverse cellular processes. Past studies have shown that these functional states can display heterogeneity between cells in microbial communities and can vary at the subcellular level. Methods to track and correlate the kinase conformational state with the phenotypic response of living bacteria cells will offer new opportunities to interrogate bacterial signaling mechanisms. As a proof of principle, we incorporated both mClover3 (donor) and mRuby3 (acceptor) fluorescent proteins into the cell-cycle HK CckA as an fluorescence resonance energy transfer (FRET) sensor to detect these structural changes. Our engineered FRET sensor was responsive to CckA-specific input signals and detected subcellular changes in CckA signal integration that occurs as cells develop. We demonstrated the potential of using the CckA FRET sensor as an screening tool for HK inhibitors. In summary, we have developed a new HK FRET sensor design strategy that can be adopted to monitor changes for interrogation of a broad range of signaling mechanisms in living bacteria.