日本語AIでPubMedを検索
Rhipicephalus haemaphysaloidesの唾液腺アポトーシスにおける開始カスパーゼと実行カスパーゼ
Initiator and executioner caspases in salivary gland apoptosis of Rhipicephalus haemaphysaloides.
PMID: 32503655 PMCID: PMC7275347. DOI: 10.1186/s13071-020-04164-5.
抄録
背景:
アポトーシスは多細胞生物の細胞バランス維持の基本であり、アポトーシス経路にはカスパーゼが重要な役割を果たしている。ダニの唾液腺変性にはアポトーシスが重要な役割を果たしていることが報告されている。マダニにはいくつかの異なるカスパーゼが存在することが知られているが、それらの相互作用は現在のところ不明である。ここでは、マダニの唾液腺から分離された3つの新しいカスパーゼを報告する。
BACKGROUND: Apoptosis is fundamental in maintaining cell balance in multicellular organisms, and caspases play a crucial role in apoptosis pathways. It is reported that apoptosis plays an important role in tick salivary gland degeneration. Several different caspases have been found in ticks, but the interactions between them are currently unknown. Here, we report three new caspases, isolated from the salivary glands of the tick Rhipicephalus haemaphysaloides.
方法:
トランスクリプトームによりＲｈＣａｓｐａｓｓ７、８、９遺伝子の全長ｃＤＮＡを得、ＲｈＣａｓｐａｓｓ７、８、９を大腸菌で発現させた；タンパク質を精製し、マウスで免疫した後、組換えタンパク質に応答して特異的ポリクローナル抗体（ＰｃＡｂ）を作製した。逆転写定量PCR（RT-qPCR）およびウエスタンブロットを用いて、ダニにおけるRhCaspases 7、8および9の存在を検出した。遺伝子サイレンシング後の異なる給餌時間における唾液腺のアポトーシスレベルを決定するためにTUNELアッセイを用いた。RhCaspases 7、8および9の間の相互作用は、共トランスフェクションアッセイによって同定された。
METHODS: The full-length cDNA of the RhCaspases 7, 8 and 9 genes were obtained by transcriptome, and RhCaspases 7, 8 and 9 were expressed in E. coli; after protein purification and immunization in mice, specific polyclonal antibodies (PcAb) were created in response to the recombinant protein. Reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and western blot were used to detect the existence of RhCaspases 7, 8 and 9 in ticks. TUNEL assays were used to determine the apoptosis level in salivary glands at different feeding times after gene silencing. The interaction between RhCaspases 7, 8 and 9 were identified by co-transfection assays.
結果:
マダニの唾液腺のアポトーシス関連遺伝子の転写は、マダニの噛み込み後に有意に増加した。保存されたカスパーゼドメインを含む3つのカスパーゼ様分子が同定され、RhCaspase7, 8, 9と命名された。RhCaspase8とRhCaspase9はN末端に長いプロドメインを持つ。RT-qPCR法により、これらの3つのカスパーゼ遺伝子の転写が、マダニの発生段階（巻き込み幼虫、ニンフ、成虫メス）の巻き込み期間中に有意に増加することが明らかになった。唾液腺におけるRhCaspase7, 8, 9の転写レベルは、巻き込み後の他の組織よりも有意に増加した。RhCaspase9-RNAi処理はマダニの摂食を有意に抑制した。対照的に、RhCaspase7およびRhCaspase8のノックダウンは、ダニの摂食に影響を及ぼさなかった。対照群と比較して、RhCaspase7、RhCaspase8およびRhCaspase9の発現を阻害した後、アポトーシスレベルが有意に低下した。共トランスフェクションアッセイでは、RhCaspase7がRhCaspase8と9によって切断されることが示され、RhCaspase8と9はイニシエーターカスパーゼであり、RhCaspase7は実行カスパーゼであることが示された。
RESULTS: The transcription of apoptosis-related genes in R. haemaphysaloides salivary glands increased significantly after tick engorgement. Three caspase-like molecules containing conserved caspase domains were identified and named RhCaspases 7, 8 and 9. RhCaspase8 and RhCaspase9 contain a long pro-domain at their N-terminals. An RT-qPCR assay demonstrated that the transcription of these three caspase genes increased significantly during the engorged periods of the tick developmental stages (engorged larval, nymph, and adult female ticks). Transcriptional levels of RhCaspases 7, 8 and 9 in salivary glands increased more significantly than other tissues post-engorgement. RhCaspase9-RNAi treatment significantly inhibited tick feeding. In contrast, knockdown of RhCaspase7 and RhCaspase8 had no influence on tick feeding. Compared to the control group, apoptosis levels were significantly reduced after interfering with RhCaspase 7, 8 and 9 expressions. Co-transfection assays showed RhCaspase7 was cleaved by RhCaspases 8 and 9, demonstrating that RhCaspases 8 and 9 are initiator caspases and RhCaspase7 is an executioner caspase.
結論:
我々の知る限りでは、本研究は、マダニの開始カスパーゼと実行カスパーゼを同定し、それらの相互作用を確認し、カスパーゼ活性化とマダニ唾液腺変性とを関連付ける初めての研究である。
CONCLUSIONS: To the best of our knowledge, this is the first study to identify initiator and executioner caspases in ticks, confirm the interaction among them, and associate caspase activation with tick salivary gland degeneration.