大動脈疾患に関連するcGMP依存性プロテインキナーゼ1の置換は、cGMP非存在下では活性型のコンフォメーションを誘導する

A substitution in cGMP-dependent protein kinase 1 associated with aortic disease induces an active conformation in the absence of cGMP.

• Matthew H Chan
• Sahar Aminzai
• Tingfei Hu
• Amatya Taran
• Sheng Li
• Choel Kim
• Renate B Pilz
• Darren E Casteel

抄録

1型cGMP依存性プロテインキナーゼ（PKG）は、ヒトの心血管生理学において重要な役割を果たしており、血管緊張や平滑筋細胞を制御しています。cGMP依存性プロテインキナーゼ1（PKG1）をコードするヒトPRKG1遺伝子の変異は、胸部大動脈瘤・解離（TAAD）を引き起こす。この突然変異は、PKG1の最初のcGMP結合ポケット内のアルギニン-グルタミン（RQ）置換を引き起こす。この置換は、ポケットへのcGMP結合を阻害するだけでなく、未知のメカニズムを介してcGMPの非存在下でPKG1が高い活性を持つようになるという予想外の結果が得られました。ここでは、ヒトPKG1αおよびPKG1βアイソフォームにおいて、RQ変異が基底キナーゼ活性を上昇させる分子機構を同定した。RQ 置換（PKG1αでは R177Q、PKG1βでは R192Q）が PKG1αおよび PKG1βの自己リン酸化を増加させることを見出したが、PKG1αの自己リン酸化の増加は検出されなかった。または PKG1β RQ バリアントの自己リン酸化の増加は検出されず、細胞内の RQ バリアントの基底活性の増加は PKG1 の自己リン酸化によるものではないことが示された。また、PKG1αのArg-177をアラニンまたはメチオニンに置換しても、基底活性が上昇した。PKG1はN末端のロイシンジッパーで連結されたパラレルホモダイマーとして存在し、WT-RQヘテロダイマーではWT鎖がRQ鎖の基底活性を部分的に低下させていることを示した。水素/重水素交換質量分析法を用いて、RQ置換によりPKG1βはcGMP非存在下ではWT酵素と同様の活性構造をとることを明らかにした。このことから、PKG1のRQ置換は、不活性構造の形成を阻害することで、PKG1の基底活性を高めると結論した。

Type 1 cGMP-dependent protein kinases (PKGs) play important roles in human cardiovascular physiology, regulating vascular tone and smooth-muscle cells. A mutation in the human PRKG1 gene encoding cGMP-dependent protein kinase 1 (PKG1) leads to thoracic aortic aneurysms and dissections (TAADs). The mutation causes an arginine-to-glutamine (RQ) substitution within the first cGMP-binding pocket in PKG1. This substitution disrupts cGMP binding to the pocket, but it also unexpectedly causes PKG1 to have high activity in the absence of cGMP via an unknown mechanism. Here, we identified the molecular mechanism whereby the RQ mutation increases basal kinase activity in the human PKG1α and PKG1β isoforms. Although we found that the RQ substitution (R177Q in PKG1α and R192Q in PKG1β) increases PKG1α and PKG1β autophosphorylation , we did not detect increased autophosphorylation of the PKG1α or PKG1β RQ variants isolated from transiently transfected 293T cells, indicating that increased basal activity of the RQ variants in cells was not driven by PKG1 autophosphorylation. Substitution of Arg-177 in PKG1α with alanine or methionine also increased basal activity. PKG1 exists as a parallel homodimer linked by an N-terminal leucine zipper, and we show that the WT chain in WT-RQ heterodimers partly reduces basal activity of the RQ chain. Using hydrogen/deuterium-exchange mass spectrometry, we found that the RQ substitution causes PKG1β to adopt an active conformation in the absence of cGMP, similar to that of cGMP-bound WT enzyme. We conclude that the RQ substitution in PKG1 increases its basal activity by disrupting formation of an inactive conformation.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.