アプタマーを用いた分離法を組み合わせた新規ラテラルフローバイオセンサーの開発.ハタの神経壊死ウイルスの迅速検出への応用

Development of a Novel Lateral Flow Biosensor Combined With Aptamer-Based Isolation: Application for Rapid Detection of Grouper Nervous Necrosis Virus.

• Jiaxin Liu
• Qiwei Qin
• Xinyue Zhang
• Chen Li
• Yepin Yu
• Xiaohong Huang
• Omar Mukama
• Lingwen Zeng
• Shaowen Wang

抄録

神経壊死ウイルス（NNV）は、世界で50種以上の魚類に感染し、養殖業に深刻な経済的損失をもたらしている。しかし、有効な抗ウイルス治療法はない。NNV感染の予防と制御のための迅速かつ正確なポイント・オブ・ケア診断法の開発が急務となっている。NNV検出のために一般的に使用されている方法には、細胞培養法、抗体法、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法などがありますが、これらの方法には欠点があります。しかし，これらの方法は時間がかかる上に複雑であるという欠点がある．本研究では、赤斑ハタ神経壊死ウイルス（RGNNV）を迅速に検出するために、アプタマーをベースとしたシンプルで高感度なラテラルフローバイオセンサー（LFB）法を開発した。アプタマーは一本鎖のヌクレオチドであり、標的に特異的に結合することができ、多くの利点を持っています。RGNNV のコートタンパク質（RGNNV-CP）に特異的に結合する以前に選択されたアプタマーに基づいて、本研究では 2 つの修飾アプタマーを使用しました。一方のアプタマーは磁気ビーズ濃縮に使用し、他方のアプタマーは等温鎖置換増幅（ＳＤＡ）に使用した。増幅後、さらにLFB法で検査したところ、検出結果は5分以内に肉眼で観察され、高い特異性と感度を示した。LFB法では、5 ng/mLまたは5×10個のRGNNV感染GB（ハタ脳）細胞からRGNNV-CPタンパク質を検出することができました。全体的に、これは、水生動物からのウイルスの迅速な診断におけるアプタマーと組み合わせたLFBの最初のアプリケーションであり、これは、養殖におけるウイルス検出のための新しい選択肢を提供します。

Nervous necrosis virus (NNV) has infected more than 50 fish species worldwide, and has caused serious economic losses in the aquaculture industries. However, there is no effective antiviral therapy. The development of a rapid and accurate point-of-care diagnostic method for the prevention and control of NNV infection is urgently required. Commonly used methods for NNV detection include the cell culture-based assay, antibody-based assay and polymerase chain reaction (PCR)-based assay. However, these methods have disadvantages as they are time-consuming and complex. In the present study, we developed a simple and sensitive aptamer-based lateral flow biosensor (LFB) method for the rapid detection of red-spotted grouper nervous necrosis virus (RGNNV). An aptamer is a single-stranded nucleotide, which can specifically bind to the target and has many advantages. Based on a previously selected aptamer, which specifically bound to the coat protein of RGNNV (RGNNV-CP), two modified aptamers were used in this study. One aptamer was used for magnetic bead enrichment and the other was used for isothermal strand displacement amplification (SDA). After amplification, the product was further tested by the LFB, and the detection results were observed by the naked eye within 5 min with high specificity and sensitivity. The LFB method could detect RGNNV-CP protein as low as 5 ng/mL or 5 × 10 RGNNV-infected GB (grouper brain) cells. Overall, it is the first application of a LFB combined with aptamer in the rapid diagnosis of virus from aquatic animals, which provides a new option for virus detection in aquaculture.

Copyright © 2020 Liu, Qin, Zhang, Li, Yu, Huang, Mukama, Zeng and Wang.