XFELでの粘性ジェットによる生体内で成長したμNS結晶のX線回折を強化した

Enhanced X-ray diffraction of in vivo-grown μNS crystals by viscous jets at XFELs.

• Nirupa Nagaratnam
• Yanyang Tang
• Sabine Botha
• Justin Saul
• Chufeng Li
• Hao Hu
• Sahba Zaare
• Mark Hunter
• David Lowry
• Uwe Weierstall
• Nadia Zatsepin
• John C H Spence
• Ji Qiu
• Joshua LaBaer
• Petra Fromme
• Jose M Martin-Garcia

抄録

μNSは、家禽産業に大きな経済的損失をもたらす鳥類レオウイルスの70kDaの主要な非構造タンパク質である。鳥類レオウイルスは、宿主細胞内のウイルス工場内で複製しており、μNSタンパク質は工場形成に必要な最小限のウイルス因子であることが示唆されている。このように、μNSの構造を決定することは、ウイルス感染における役割を理解する上で非常に重要である。ここで紹介する研究では、μNSの残基４４８〜６０５からなるフラグメントを、Sf9昆虫細胞においてEGFP融合タンパク質として発現させた。Sf9細胞におけるEGFP-μNSの結晶化を、いくつかのイメージング技術によってモニターし、検証した。EGFP-μNSバキュロウイルスに感染した細胞は、棒状の微結晶（長さ5～15μm）を形成し、高粘度培地（LCPとアガロース）で再構成し、X線自由電子レーザー（XFEL）の粘性ジェットを用いたフェムト秒連続X線回折で調べた。結晶は4.5Åの分解能で回折した。合計4227回の回折スナップショットを、単位セルパラメータa=109.29, b=110.29, c=324.97Åの六方格子にインデックス化することに成功した。最終的なデータセットは、7.0Åの分解能でマージされ、洗練されたものとなった。予備的な電子密度マップが得られた。μNSの構造を解明するためには、より多くの回折データが必要であるが、XFELでの高粘度結晶輸送とインセルロ結晶化を組み合わせた現在の実験戦略は、μNSタンパク質の構造決定への道を開くものである。

μNS is a 70 kDa major nonstructural protein of avian reoviruses, which cause significant economic losses in the poultry industry. They replicate inside viral factories in host cells, and the μNS protein has been suggested to be the minimal viral factor required for factory formation. Thus, determining the structure of μNS is of great importance for understanding its role in viral infection. In the study presented here, a fragment consisting of residues 448-605 of μNS was expressed as an EGFP fusion protein in Sf9 insect cells. EGFP-μNS crystallization in Sf9 cells was monitored and verified by several imaging techniques. Cells infected with the EGFP-μNS baculovirus formed rod-shaped microcrystals (5-15 µm in length) which were reconstituted in high-viscosity media (LCP and agarose) and investigated by serial femtosecond X-ray diffraction using viscous jets at an X-ray free-electron laser (XFEL). The crystals diffracted to 4.5 Å resolution. A total of 4227 diffraction snapshots were successfully indexed into a hexagonal lattice with unit-cell parameters a = 109.29, b = 110.29, c = 324.97 Å. The final data set was merged and refined to 7.0 Å resolution. Preliminary electron-density maps were obtained. While more diffraction data are required to solve the structure of μNS, the current experimental strategy, which couples high-viscosity crystal delivery at an XFEL with in cellulo crystallization, paves the way towards structure determination of the μNS protein.

open access.