Bacillus cereus株AOA-CPS_1からの代謝活性な鉄依存性2,6-ジクロロ-p-ヒドロキノン1,2-ジオキシゲナーゼ（CpsA）のクローニング、過剰発現、精製、特性評価および構造モデル化

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Int. J. Biol. Macromol..2020 Jun;161:247-257. S0141-8130(20)33438-3. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2020.05.268.Epub 2020-06-05.

Bacillus cereus株AOA-CPS_1からの代謝活性な鉄依存性2,6-ジクロロ-p-ヒドロキノン1,2-ジオキシゲナーゼ（CpsA）のクローニング、過剰発現、精製、特性評価および構造モデル化

Cloning, overexpression, purification, characterization and structural modelling of a metabolically active Fe dependent 2,6-dichloro-p-hydroquinone 1,2-dioxygenase (CpsA) from Bacillus cereus strain AOA-CPS_1.

Oladipupo A Aregbesola
Ajit Kumar
Mduduzi P Mokoena
Ademola O Olaniran

PMID: 32512093 DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.05.268.

抄録

DiCHQ 1,2-ジオキシゲナーゼ（CpsA）による2,6-ジクロロ-p-ヒドロキノン（DiCHQ）芳香環切断は、バチルス・セレウスAOA-CPS_1（Bacillus cereus AOA-CPS_1）（BcAOA）におけるペンタクロロフェノール（PCP）の2-クロロマレイアセテートへの完全変換に非常に重要である。978bp遺伝子（cpsA）を検出し、BcAOAのゲノム中で増幅した；クローン化し、過剰発現させ、均質に精製した。CpsA は SDS-PAGE 上で単一の≅36.9kDa のタンパク質バンドを示し、30℃および pH9.0 で最適な活性を示しました。CpsAは20℃から40℃の間で安定であり、60℃で120分間、約90%の活性を保持した。酵素はpH9.0から11.5の間で約90%の活性を保持し、pH13.0では約60%の活性を保持した。CpsAはFeSOの存在下で約90%の活性上昇が観察されたことから、Fe依存性が認められた。CpsAは、pH9.0でそれぞれ27.77±0.9μMs、0.990±0.03mM、4.20±0.04s及び4.24±0.03smMの見かけのv、K、k及びk/Kを示した。反応生成物をGC-MSで分析した結果、2-クロロマレイアセテートが環切断生成物であることが確認された。CpsAの立体構造からは、保存された2-His-1-カルボキシラート顔面三角モチーフ(His 9, His 244, Thr 11)が、中心にFeを持つことが明らかになった。本研究から得られた知見は、PCP分解におけるこの酵素の関与についての新たな知見を提供するとともに、ジオキシゲナーゼによる環状切断の代替メカニズムの可能性を示唆するものである。

2,6-Dichloro-p-hydroquinone (DiCHQ) aromatic-ring cleavage by DiCHQ 1,2-dioxygenase (CpsA) is very crucial for complete transformation of pentachlorophenol (PCP) to 2-chloromaleylacetate in Bacillus cereus AOA-CPS_1 (BcAOA). The 978 bp gene (cpsA) was detected and amplified in the genome of BcAOA; cloned, overexpressed and purified to homogeneity. CpsA showed a single ≅36.9 kDa protein band on SDS-PAGE and exhibited optimum activity at 30 °C and pH 9.0. CpsA was stable between 20 °C and 40 °C, and also retained about 90% of its activity at 60 °C for 120 min. The enzyme retained about 90% activity between pH 9.0 and 11.5 and 60% activity at pH 13.0. CpsA was found to be Fe dependent as about 90% increased activity was observed in the presence of FeSO. CpsA showed apparent v, K, k and k/K of 27.77 ± 0.9 μMs, 0.990 ± 0.03 mM, 4.20 ± 0.04 s and 4.24 ± 0.03 s mM, respectively at pH 9.0. Analysis of the reaction products via GC-MS confirmed 2-chloromaleylacetate as the ring-cleavage product. CpsA 3D structure revealed a conserved 2-His-1-carboxylate facial triad motif (His 9, His 244 and Thr 11), with Fe at the centre. Findings from this study provide new insights into the involvement of this enzyme in PCP degradation and suggests alternate possible mechanism of ring-cleavage by dioxygenases.